新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途制造技术

本发明专利技术涉及proNGF突变体及其用途，具体而言是proNGF突变体用于生产人β‑NGF的用途。本发明专利技术公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体制备生物活性的人β‑NGF的方法。本发明专利技术的proNGF突变体在天然蛋白酶切割位点R

Novel proNGF mutants and their application in production of beta-NGF

The present invention relates to proNGF mutant and its use, in particular to the use of proNGF mutant for the production of human beta NGF. The present invention discloses a method for preparing bioactive human beta NGF from inactive insoluble proNGF mutants. The proNGF mutant of the present invention is at natural protease cleavage site R

【技术实现步骤摘要】
新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途
本专利技术涉及在天然蛋白酶切割位点处具有取代的新型proNGF突变体。本专利技术进一步公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体来生产生物活性的人β-NGF的方法，及proNGF突变体用于生产人β-NGF的用途。
技术介绍
神经生长因子(β-NGF)是在神经元(感知和交感的)的生长和存活中起关键作用的神经营养因子(Levi-Montalcini,R.,Science237(1987)1154；Thoenen,H.,etal.,Physiol.Rev.60(1980)1284；Yankner,B.A.,etal.,Annu.Rev.Biochem.51(1982)845)。β-NGF属于生长因子的半胱氨酸结超家族，假设其为稳定的二聚体蛋白质结构。此外，β-NGF促进中枢神经系统的类胆碱能神经元的生长、分化和活力(Hefti,F.J.,J.Neurobiol.25(1994)1418)。用于重组人神经生长因子的可行的治疗适应症包括外周感觉神经病变，例如与糖尿病有关或者在AIDS治疗中可能的副作用。用于β-NGF的其他适应症为中枢神经病变，例如Alzheimer病。在这种情况下，记忆丧失是类胆碱能神经元缺失的结果。此外，还发现β-NGF有效用于治疗人皮肤癌和角膜癌(Bernabeietal.Lancet1999；Lambiaseetal.NEJM1998)。此外，青光眼的试验动物模型中，β-NGF还显示保护视网膜细胞免于退化和细胞凋亡，以及在一些受青光眼影响的患者中改善视觉功能(LambiaseA,etal.PNAS2009)。成熟的人β-NGF为118个氨基酸的蛋白质，其被翻译为前原蛋白由241个氨基酸组成。18个氨基酸的信号肽(前肽)在转移至内质网(ER)的过程中被切割。所得的前蛋白(proNGF)通过蛋白酶切割除去原序列而在其N-末端被加工。成熟的人NGF显示与啮齿动物(鼠科和大鼠)β-NGF具有高度的一致性(大约90％)。就临床研究或治疗用途而言，必须以高浓度提供β-NGF。小鼠的颌下腺是β-NGF的天然来源。但是，这些β-NGF的制备是不同二聚体的各种混合物，因此不适用于治疗用途。此外，理想的是给与患者人类形式的蛋白质。但是，在人类组织中，神经营养因子仅以低浓度存在。原序列为区别于成熟蛋白质的结构域(参见图1中的序列数据，其中原序列以黑体表示)。这两个结构域通过暴露的蛋白酶切割位点而分离，其中所述的蛋白酶切割位点为位于人proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101至104处的典型Arg-Ser-Lys-Arg的碱性氨基酸靶序列。该基元为丝氨酸内切蛋白酶成对碱性氨基酸蛋白酶的天然切割位点。此外，所述的切割位点可以通过其他合适的蛋白酶进行特异性的加工，优选的是在氨基酸精氨酸(Arg，R)之后具有底物切割特异性的蛋白酶。例如，蛋白酶胰蛋白酶在碱性氨基酸(例如赖氨酸(Lys，K)或精氨酸(Arg，R))之后进行切割。用于由无活性原形式的β-NGF制备生物活性的β-NGF的方法是本领域公知的。例如，EP0994188Bl描述了由溶解度较低的无活性的原形式β-NGF制备生物活性的β-NGF的方法。根据该方法，β-NGF可由重组不可溶的无活性proNGF得到，其中所述的不可溶的无活性proNGF溶解于变性溶液中。之后，将溶解的proNGF转移至非或弱的变性溶液中。变性的proNGF假设为生物活性构造，这可通过天然β-NGF中存在的二硫键测定。随后，proNGF的原序列被切割，由此得到活性的β-NGF。人proNGF包含天然蛋白酶(成对碱性氨基酸蛋白酶)切割位点Arg-Ser-Lys-Arg，因此具有以下序列基元：R1SK3R4。就特定的生产过程(例如需要“良好作业规范”(GMP)质量水平的那些)而言，诸如酶之类的材料必须以高品质提供。目前，蛋白酶成对碱性氨基酸蛋白酶并非为GMP级可利用的蛋白酶。因此，选择备选的蛋白酶(胰蛋白酶(EC3.4.21.4))来切割proNGF，从而得到成熟的β-NGF蛋白质。丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶在碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸的羧基一侧切割肽链。在人proNGF中，人proNGF中天然形成的切割位点包含具有碱性氨基酸的3个位置(SEQIDNO:1的位置101、103和104；在本文中备选地称为R1、K3和R4)。因此，通过胰蛋白酶切割proNGF可以根据切割发生的确切位点而得到多种不同的切割产物。典型的切割产物为SK3R4-β-NGF和R4-β-NGF、以及成熟的β-NGF。由于β-NGF蛋白质的二聚化将导致更多数量(至多达6种)的不均一的产物，这些产物必须在随后的步骤中纯化，所以该问题恶化(参见图2a)。本专利技术潜在的技术问题及其解决方法用于生产β-NGF的方法在现有技术中已经描述。但是，目前可利用的生产过程具有几个缺点，例如不均一的β-NGF产物和β-NGF的低产率。使用胰蛋白酶切割野生型proNGF来生产β-NGF显示效率较低，这迫使使用极大量的酶以便得到足够产率的切割β-NGF。这具有多个缺点，它们都会影响随后的纯化过程。首先，其进一步降低了切割的选择性，这导致消化的多种产物。其次，必须将β-NGF由酶中纯化出来，这是因为所述的酶毫无疑问不能存在于最终的蛋白质样品中。这意味着多个纯化工序以除去大量的胰蛋白酶。因此，在现有技术的工序中将胰蛋白酶作为切割酶使用会导致β-NGF极低的产率或蛋白质的纯化问题。本领域当然仍需要不具有上述缺点的生产β-NGF的方法。因此，本专利技术潜在的问题是提供以高品质、高效率和高产率来生产β-NGF的新方法。此外，本专利技术潜在的问题是提供β-NGF的生产过程，其得到高产率的β-NGF，并且是有效的、强力的、可升级的且可再生的。本专利技术的优点是由新型的proNGF突变体来生产β-NGF。新型的突变体会得到产率良好的均一的β-NGF产物，这是因为新型的proNGF突变体会防止被蛋白酶不均一的消化并由此得到不均一的β-NGF产物。本专利技术的问题通过提供本专利技术的proNGF突变体以及通过本专利技术所述由该proNGF突变体来生产β-NGF的方法而得到解决。与野生型相比，新型突变体使得在本专利技术的突变proNGF中的相关位点处，胰蛋白酶的切割效率意外且显著地增高。与野生型中使用的量相比，上述结果允许使用极低量的蛋白酶胰蛋白酶，结果使得由酶本身及由切割产物所产生的β-NGF的纯化问题减少。上述问题得到解决并且优点通过独立权利要求的主题而取得。本专利技术的优选的实施方案包含在从属权利要求中，以及以下说明书、实施例和附图中。上述概述不必描述本专利技术所解决的所有问题。其他问题以及解决方法在技术人员研究本申请之后可以是显而易见的。专利技术概述本专利技术的第一个方面涉及proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点至少在R1和K3位置处被选自非碱性氨基酸和组氨酸的氨基酸所取代，其中所述的R1和K3位置对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103。本专利技术的第二个方面涉及由无活性的不可溶的proNGF突变体来制备生物活性的人β-NGF的方法，其中所述的proNGF突变体至少在天然蛋白酶切割位点R1SK3R4的位置R1和K3处被本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点R1SK3R4在位置R1和K3被选自非碱性氨基酸和组氨酸的任何氨基酸取代，所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQ ID NO:1)的位置101和103。

【技术特征摘要】
2011.12.19 EP 11194208.21.一种proNGF突变体，其中蛋白酶切割位点R1SK3R4在位置R1和K3被选自非碱性氨基酸和组氨酸的任何氨基酸取代，所述的位置R1和K3对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101和103。2.根据权利要求1所述的proNGF突变体，其中所述的蛋白酶切割位点在所述的位置101和103处被选自以下的一种氨基酸取代：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、半胱氨酸和脯氨酸，优选选自丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸，更优选选自丙氨酸和缬氨酸。3.根据权利要求1或2所述的proNGF突变体，其中在所述的位置R4处的氨基酸选自精氨酸或赖氨酸，其中所述的位置R4对应于人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置104。4.根据权利要求1至3所述的proNGF突变体，其中在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置102处的取代氨基酸选自丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸。5.根据权利要求1至4所述的proNGF突变体，其中在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置101处的氨基酸被缬氨酸取代，在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置102处的氨基酸被丝氨酸取代，在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置103处的氨基酸被丙氨酸取代，并且其中在人野生型proNGF序列(SEQIDNO:1)的位置104处的氨基酸是精氨酸。6.根据权利要求1至5所述的具有SEQIDNO:5的proNGF突变体。7.根据权利要求1至6所述的proNGF突变体，其中所述的突变体是通过在原核细胞优选在大肠杆菌中重组表达而获得的，优选地在E.coli。8.一种制备生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·洛里，B·简诺瓦斯基，H·帕特克，D·卡特曼，A·帕蒂尔，A·安东，
申请(专利权)人：瓦克化学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE