DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用技术

本发明专利技术属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。该DNA条形码能够准确鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，可以快速准确地将该菌株从易混淆的菌株或同物种内其他菌株中鉴定出来。

DNA Barcode, Primers, Kits, Methods and Applications

The invention belongs to the field of species and strain identification, in particular to a DNA barcode, primers, kits, methods and applications for identifying adenine-eating Arthrospora yeast strains. The DNA barcode can identify adenine-eating Arthrospora sp. TMCC 70007 accurately and quickly from confusing strains or other strains in the same species.

【技术实现步骤摘要】
DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用
本专利技术属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。
技术介绍
普洱茶是一种具有云南地理标识的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。传统的普洱茶制作过程为：采摘的新鲜茶叶经揉捻、晒青、除杂、潮水、渥堆、晾干、筛分、压制成型、包装出厂。在普洱茶的生产中，渥堆发酵过程是普洱茶品质形成的主要因素，在此过程中，茶叶中诸如茶多酚、咖啡因以及一些多糖物质等内含成分发生了巨大变化，成就了普洱茶的特殊风味、口感、品质以及各种保健功效。传统的普洱生产中，湿热的环境激活茶叶本身所含的酶，把茶叶中所含的一部分内含成分转化成微生物能利用的物质，微生物大量滋生，产生丰富的胞内酶和胞外酶，催化茶叶中包含的成分发生一系列转变，再加上湿热等其他因素，逐渐形成不同品质的普洱茶。不同的产地，因为其微生物群落结构的不同，风味及品质也各具特色。普洱茶除了其独特的风味和文化外，其诸如减肥、降血糖血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注。近年来，普洱茶越来越受欢迎，逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区经济增长。然而，普洱茶也面临着一些困境，例如产品质量不稳定、存在一定安全隐患、生产周期长、劳动力投入过高、微生物数量超标和螨虫滋生等。随着人们生活水平的提高，消费者对食品的卫生、安全等问题日益重视。近几年食品质量安全事件频发，茶叶质量的安全问题也日益突出，除了农药的残留问题之外，渥堆发酵过程中微生物也有可能成为影响茶叶质量的重要因素。目前多数厂家的普洱茶生产仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)等优势共性微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间。生产过程中也不可避免的存在着一定的安全隐患，为了进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒、提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产工艺的人工可控化、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，专利技术一系列安全、清洁、高效、人工可控自动化的普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展，给国家和人民带来长远利益。随着普洱茶科研的进一步深入，越来越多的人们开始了人工接种发酵普洱茶的探索，目前已经有许多菌株应用于普洱茶人工可控发酵。近年由于市场需求加大，许多规模较小的厂家对普洱茶缺乏系统深入的研究，大肆滥用许多他人专利进行牟利，比如，按照一些接种发酵普洱茶的专利方法，采用一些菌种进行普洱茶发酵等一系列方法，进行普洱茶加工生产等经营活动，大大损害了一些具有相关专利的普洱茶生产企业的经济利益。为确保普洱茶发酵微生物种质资源得到有效保护，防止滥用普洱茶发酵微生物的侵权行为发生，解决在普洱茶人工可控发酵过程中菌种侵权时难以举证的难题，开发对普洱茶发酵用菌株进行快速精准鉴别的方法势在必行，亟需建立其分子鉴定方法，开发通过DNA条形码技术准确鉴别与区分与其相似菌株的方法，以达到通过形态特征与分子数据分析相结合的方法来解决工业生产菌株鉴别和鉴定问题，为普洱茶有控工业发酵工艺开发和资源保护提供理论依据，促进普洱茶产业健康繁荣发展。
技术实现思路
为了克服形态学鉴定用于普洱茶发酵生产的食腺嘌呤节孢酵母菌株所存在的不足，本专利技术提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用，从而对食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株进行快速鉴别和区分，可为普洱茶新发酵工艺提供快速评估，防止发酵过程中其他杂菌的干扰，以及为普洱茶人工可控发酵工艺及菌种非法滥用提供举证方法和依据。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：(1)一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组，并且包含选自如SEQIDNo.1所示的DNA序列中的至少600bp的序列，并且该DNA条形码的长度为600bp-3000bp，优选为600bp-2200bp，更优选为600bp-1500bp。(2)根据(1)所述的DNA条形码，其核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.4或SEQIDNo.7所示。(3)一种用于扩增根据(1)所述的DNA条形码的引物对。(4)根据(3)所述的引物对，其正向引物的核苷酸序列与食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC70007菌株基因组中如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的第1位的上游1000bp到如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的第589位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为20-30bp；其反向引物与所述TMCC70007菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC70007菌株基因组中如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的第601位到如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的最后一位的下游1000bp的区域中的序列，并且该反向引物的长度为20-30bp。(5)根据(4)所述的引物对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：正向引物：5’-GCTCAACTGCCAATGGTTCA-3’；反向引物：5’-CTTGCCATGGTGGTGGGATA-3’。(6)一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含根据(3)所述的引物对。(7)一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：a)提供待测菌株的基因组DNA；b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据(3)所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；c)电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株，如果有目标条带，则进行步骤d)；d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与权利要求1所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上，则判定待测菌株是食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株。(8)根据(1)所述的DNA条形码在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。(9)根据(3)所述的引物对在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。(10)根据(6)所述的试剂盒在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：1、本专利技术采用蛋白质基因组学技术从食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组中发现了一个漏注释编码蛋白，并且发现编码该蛋白的基因的开放阅读框(SEQIDNo.1)为食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组所特有。本专利技术进一步通过仔细的研究和比较分析，将该特有的DNA序列开发为了DNA条形码，作为鉴别普洱茶工业发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007的有效工具。该条形码序列能实现食腺嘌呤节孢酵母种内菌株的快速准确鉴别与区分。2、与现有技术相比，本专利技术采用蛋白质基因组学技术发现的DNA条形码的特异性更好。3、本专利技术进一步发现，相比于其他基因，ARC19基因中的序列(例如SEQIDNo.1)具有通用、易扩增、易比对的特点，其在食腺嘌呤节孢酵母种内不同菌株之间差异明显。4、本专利技术建立了普洱茶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.1所示的DNA序列中的至少600bp的序列，并且该DNA条形码的长度为600bp‑3000bp，优选为600bp‑2200bp，更优选为600bp‑1500bp。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组，并且包含选自如SEQIDNo.1所示的DNA序列中的至少600bp的序列，并且该DNA条形码的长度为600bp-3000bp，优选为600bp-2200bp，更优选为600bp-1500bp。2.根据权利要求1所述的DNA条形码，其核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.4或SEQIDNo.7所示。3.一种用于扩增权利要求2所述的DNA条形码的引物对。4.根据权利要求3所述的引物对，其正向引物的核苷酸序列与食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC70007菌株基因组中如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的第1位的上游1000bp到如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的第589位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为20-30bp；其反向引物与所述TMCC70007菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC70007菌株基因组中如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的第601位到如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的最后一位的下游1000bp的区域中的序列，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：田飞，徐平，唐蜀昆，施佳辉，周文婧，高林瑞，高慧英，职晓阳，丁章贵，卢开阳，
申请(专利权)人：勐海茶业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53