天冬氨酸酶变体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种天冬氨酸酶变体及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的天冬氨酸酶变体其氨基酸序列与序列表中序列2相比具有96％以上同一性，且在序列2的第187位和326位分别存在T187I和N326C的突变，并且与序列2所示的天冬氨酸酶相比具有改善的催化丙烯酸加氨活性。实验证明，本发明专利技术所提供的天冬氨酸酶变体与野生型亲本天冬氨酸酶相比确实具有改善的催化丙烯酸加氨活性，且热稳定性和pH谱更优，在丙烯酸加氨反应中可以大大提高丙烯酸的转化率。

Aspartase variants and their preparation methods and Applications

The invention discloses an aspartase variant, a preparation method and application thereof. The amino acid sequence of the aspartase variant provided by the present invention is more than 96% identical with that of sequence 2 in the sequence list, and there are mutations of T187I and N326C at position 187 and 326 of sequence 2, respectively, and it has improved catalytic activity for ammonia addition of acrylic acid compared with the aspartase shown in sequence 2. Experiments show that the aspartase variant provided by the invention has improved catalytic activity for ammonia addition of acrylic acid, better thermal stability and pH spectrum, and can greatly improve the conversion of acrylic acid in the reaction of ammonia addition of acrylic acid.

【技术实现步骤摘要】
天冬氨酸酶变体及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，涉及天冬氨酸酶变体及其制备方法与应用。
技术介绍
天冬氨酸酶(aspartase,E.C.4.3.1.1)，又名天冬氨酸解氨酶(aspartateammonia-lyase)，广泛存在于细菌、酵母和植物中。来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶由4个相同的亚基组成，其中每个亚基由207个氨基酸残基组成，且每个亚基的分子量为52.2KDa。具有活性的天冬氨酸酶均是以四聚体形式存在的，其单体无活性。从四聚体解聚成二聚体的过程是可逆的，二聚体结构的活性是四聚体活性的45％。天冬氨酸酶是一种别构酶，其最适pH值为8.0，温度为37℃。当pH>7.5时，该酶的活性主要依赖于二价金属离子和天冬氨酸；当pH<7.5时，可不需二价金属离子而催化脱氨反应。天冬氨酸酶在体内的主要功能是分解L-天冬氨酸作为碳源。以大肠杆菌为例，当培养基中含有葡萄糖时，天冬氨酸酶的表达受到抑制，在该情况下，即使培养基中L-天冬氨酸作为唯一的碳源，也不会促进天冬氨酸酶的表达。天冬氨酸酶除了在基因水平上受到调控外，酶自身也具有调控功能。当酶的表达量低时，不易形成四聚体，导致活力下降。此外，该酶受天冬氨酸激活，天冬氨酸浓度低时酶活也低。天冬氨酸酶属于富马酸酶超家族的成员，该家族包括来源于不同生物物种的天冬氨酸酶、富马酸酶、精氨琥珀酸裂解酶。天冬氨酸酶-富马酸酶甲酸的成员均不需要辅酶或辅基参与催化反应，它们可能是由一个识别富马酸的不具调节功能的四亚基酶为基础而衍生出这个家族的酶，该家族成员均保留了打开富马酸双键的这一共同功能。富马酸酶能够催化富马酸被水打开双键，精氨酸琥珀酸裂解酶能够催化富马酸被精氨酸打开双键，而天冬氨酸酶可以催化富马酸被NH4+来打开双键。正是由于天冬氨酸酶的这一特定功能，在工业中其广泛地应用于催化富马酸和氨生成L-天冬氨酸的生产中，且该反应为可逆反应。近三十年来，研究工作者在天冬氨酸酶催化富马酸和氨生成L-天冬氨酸的催化位点和反应机理进行了大量的研究工作。人们对天冬氨酸酶与底物的反应机理变得越来也清楚，这也为天冬氨酸酶的定向改造奠定了一定的理论基础。根据天冬氨酸酶能够将底物的氨基去除形成α,β双键的这一特性，人们试图改变其催化机制以合成光学纯度较高的其他种类的α氨基酸。然而，由于天冬氨酸酶的底物专一性较强，在拓宽天冬氨酸酶作用底物范围方面的研究工作进展相对缓慢。Asano等人(Biomol.Eng(2005)22:95-101)发现对天冬氨酸酶的Lys327位点进行诱变，可使其催化β-天冬酰胺脱氨，然而其催化酶活非常低。想要增加其底物作用范围可能需要对SS-loop底物结合区域进行改变，这对天冬氨酸酶的蛋白改造而言是一个巨大的挑战。与富马酸的结构类似，丙烯酸中也含有1个不饱和双键直接和羧基相连。将丙烯酸双键打开加NH4+生成β-丙氨酸，一直以来被认为是一种最简单的β-丙氨酸合成工艺。然而，目前β-丙氨酸(β-Alanine)的生产仍然主其要采用传统丙烯腈加氨的化学合成方法。该方法存在副产物多、能耗大、环境污染大等问题。鉴于此，国内外的研究工作者们在丙烯酸氨化合成β-丙氨酸的研究中进行了大量的探索工作，然而至今未有报道可工业化的酶法合成工艺。据文献调研，楼坚(生物转化法生产β-丙氨酸的研究，2006)筛选得到一株含β-丙氨酸合成酶的藤黄八叠球菌。通过诱变和条件优化后，其丙烯酸转化率仍仅为1.25％，远远无法满足工业化的需求。野生型的天冬氨酸酶对富马酸有着高度的底物专一性，其催化丙烯酸加氨生成β-丙氨酸的酶活仅为0.01U/mg左右。
技术实现思路
本专利技术的目的是对野生型天冬氨酸酶进行改造，改善其促进丙烯酸加氨生成β-丙氨酸的催化活性。本专利技术首先提供了如下天冬氨酸酶变体，其氨基酸序列与序列表中序列2(来源于芽孢杆菌的野生型天冬氨酸酶)相比具有96％以上同一性，并且在序列2的第187位和第326位同时存在T187I和N326C的突变，并且与序列2所示的天冬氨酸酶相比具有改善的催化丙烯酸加氨活性。其中，序列2所示的野生型天冬氨酸酶为蛋白成熟体：术语“蛋白成熟体”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N端加工，C端截短，糖基化，磷酸化等)之后以其最终形式存在的蛋白质。换言之，蛋白成熟体指前体蛋白在切割去信号肽部分以及前肽部分(若有的话)之后遗传的部分。信号肽部分可通过本领域中已知的程序(例如SignalP)来预测。序列2的第1至468位氨基酸残基是预期的成熟部分。一般而言，酶成熟部分的第一个氨基酸可通过纯化酶的N端测序来完成。这里的技术术语“同一性”是指两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本专利技术而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS包(EMBOSS：TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,等，2000，TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(优选版本3.0.0或更新版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的可选参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标以“最长同一性(longestidentity)”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出作为百分比同一性，并如下所示计算：(相同残基*100)/(比对长度-比对中缺口总数)在本专利技术中，所述“96％以上同一性”可理解为96％、97％、98％或99％的序列同一性；也可以进一步理解为98.0％、98.2％、98.4％、98.6％、98.8％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％或99.4％，但小于100％的序列同一性。这里的“改善的催化丙烯酸加氨活性”意指在升高的温度，在升高浓度或升高pH值的底物中，在变体的工业使用或运输过程中存在的那些的条件下储存一段时间之后，显示高于亲本(序列2所示的野生型天冬氨酸酶)催化丙烯酸加氨活性的变体。本专利技术的天冬氨酸酶变体可与亲本天冬氨酸酶相比具有改善的催化丙烯酸加氨活性，其中改善的催化丙烯酸加氨活性作为增加的相对活性确定。在一个方面，当使用实施例中用于确定转氨活性的测定法相比较时，具有改善的催化丙烯酸加氨活性的变体的酶活是亲本酶活的至少1.5倍，例如至少2.0倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，至少25倍，至少30倍，至少35倍、至少45倍或至少55倍。进一步，所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与序列表中序列2相比，还存在如下位置的突变：第20位、第75位、第89位、第156位、第164位、第204位、第226位、第258位、第285位、第321位、第324位、第381位、第389位、第406位、第426位和/或第456位；优选存在2、3、4、5、6、7、8或9处突变。更进一步，所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与序列表中序列2相比，还存在下述突变：D20V、V75E、Q89H、L156F、T164I、Y204C、N226I、L258I、M285L、M321I、K3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.天冬氨酸酶变体，其氨基酸序列与序列表中序列2相比具有96％以上同一性，且在序列2的第187位和第326位同时存在T187I和N326C的突变，并且与序列2所示的天冬氨酸酶相比具有改善的催化丙烯酸加氨活性。

【技术特征摘要】
1.天冬氨酸酶变体，其氨基酸序列与序列表中序列2相比具有96％以上同一性，且在序列2的第187位和第326位同时存在T187I和N326C的突变，并且与序列2所示的天冬氨酸酶相比具有改善的催化丙烯酸加氨活性。2.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶变体，其特征在于：所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与序列表中序列2相比，还存在如下位置的突变：第20位、第75位、第89位、第156位、第164位、第204位、第226位、第258位、第285位、第321位、第324位、第381位、第389位、第406位、第426位和/或第456位；优选存在2、3、4、5、6、7、8或9处突变。3.根据权利要求2所述的天冬氨酸酶变体，其特征在于：所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与序列表中序列2相比，还存在如下突变：D20V、V75E、Q89H、L156F、T164I、Y204C、N226I、L258I、M285L、M321I、K324I、K381R、K389I、I406L、R426C和/或P456L；优选存在2、3、4、5、6、7、8或9处突变。4.根据权利要求3所述的天冬氨酸酶变体，其特征在于：所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与序列表中序列2相比，存在或仅存在如下1)-385)中任一所示突变组合：1)V75E/Q89H/T187I/L258I/N326C/K381R/K389I；2)D20V/Q89H/L156F/T164I/T187I/Y204C/L258I/M285L/N326C/K381R/R426C；3)Q89H/L156F/T164I/T187I/L258I/N326C/K389I/I406L/R426C；4)L156F/T164I/T187I/L258I/K324I/N326C/K389I；5)D20V/L156F/T164I/T187I/Y204C/N226I/M321I/K324I/N326C/K389I/R426C；6)L156F/T187I/Y204C/K324I/N326C/K389I/I406L；7)T187I/N226I/M285L/M321I/K324I/N326C/K381R/K389I/I406L/P456L；8)D20V/Q89H/L156F/T187I/M285L/N326C/K381R/K389I；9)D20V/Q89H/T164I/T187I/Y204C/N226I/K324I/N326C；10)L156F/T164I/T187I/L258I/N326C/I406L/R426C；11)V75E/T187I/N226I/L258I/K324I/N326C/K381R/I406L；12)V75E/T187I/L258I/M285L/N326C/I406L；13)L156F/T187I/N226I/L258I/N326C/I406L；14)D20V/L156F/T164I/T187I/N226I/M285L/M321I/K324I/N326C/I406L/R426C；15)V75E/T187I/N226I/M321I/K324I/N326C/P456L；16)V75E/Q89H/L156F/T187I/N326C/K381R/R426C；17)T187I/N226I/M321I/N326C/K389I/I406L；18)V75E/L156F/T187I/M285L/M321I/K324I/N326C/K381R/P456L；19)Q89H/L156F/T164I/T187I/Y204C/N226I/M285L/K324I/N326C/K381R；20)T187I/N226I/M321I/N326C/I406L/R426C；21)V75E/L156F/T187I/N226I/L258I/M285L/N326C；22)V75E/Q89H/L156F/T164I/T187I/N226I/N326C/K389I/I406L；23)Q89H/T164I/T187I/Y204C/N226I/K324I/N326C/K381R/R426C；24)D20V/Q89H/L156F/T187I/Y204C/M285L/K324I/N326C/K381R/K389I；25)D20V/T164I/T187I/N226I/L258I/M285L/K324I/N326C；26)V75E/Q89H/T187I/Y204C/L258I/M321I/N326C/K381R/K389I/I406L/R426C；27)V75E/Q89H/T164I/T187I/Y204C/N226I/M285L/M321I/N326C/K389I/R426C；28)D20V/V75E/T187I/N226I/L258I/M285L/N326C/R426C；29)D20V/Q89H/L156F/T187I/N226I/N326C/K381R/K389I；30)D20V/V75E/L156F/T187I/N226I/M321I/K324I/N326C/R426C/P456L；31)V75E/Q89H/T164I/T187I/M321I/N326C/K381R/K389I/R426C；32)D20V/V75E/T164I/T187I/Y204C/M285L/M321I/N326C/K381R/R426C；33)V75E/T164I/T187I/M321I/N326C/K381R/I406L；34)V75E/L156F/T187I/Y204C/M321I/N326C/K389I/R426C；35)T187I/M285L/N326C/I406L/R426C/P456L；36)D20V/Q89H/T164I/T187I/M285L/N326C/K381R；37)Q89H/T187I/Y204C/L258I/M321I/K324I/N326C/K381R/R426C；38)V75E/Q89H/T187I/Y204C/L258I/M285L/M321I/N326C/I406L/R426C；39)D20V/T187I/Y204C/L258I/N326C/K381R；40)T187I/N226I/N326C/I406L/P456L；41)D20V/L156F/T187I/L258I/M321I/K324I/N326C；42)V75E/Q89H/L156F/T187I/M321I/N326C/R426C；43)T187I/Y204C/N226I/M285L/M321I/N326C/K381R/K389I/I406L/P456L；44)Q89H/T187I/N226I/M285L/M321I/K324I/N326C/K389I；45)V75E/L156F/T164I/T187I/Y204C/N226I/L258I/N326C/I406L；46)V75E/Q89H/L156F/T164I/T187I/Y204C/M285L/N326C/K381R/K389I/R426C；47)D20V/V75E/L156F/T187I/N326C/K381R/R426C；48)V75E/T187I/L258I/N326C/K381R；49)D20V/V75E/T164I/T187I/M285L/M321I/N326C/K381R/R426C；50)T187I/N226I/L258I/N326C/I406L；51)V75E/T164I/T187I/M321I/N326C/I406L；52)T187I/L258I/M285L/M321I/N326C；53)D20V/Q89H/T187I/Y204C/L258I/M285L/N326C/K389I；54)D20V/T187I/L258I/K324I/N326C/R426C；55)T187I/Y204C/M285L/N326C/K381R；56)T187I/Y204C/L258I/M285L/M321I/K324I/N326C/K381R/K389I/I406L；57)Q89H/T187I/L258I/M285L/K324I/N326C/I406L；58)D20V/V75E/T187I/N226I/L258I/K324I/N326C/K381R/K389I/P456L；59)D20V/T164I/T187I/N226I/L258I/N326C/K389I；60)T187I/Y204C/N326C/I406L/P456L；61)D20V/T164I/T187I/L258I/M285L/K324I/N326C/I406L；62)Q89H/T187I/M285L/N326C/K381R；63)V75E/T187I/L258I/K324I/N326C/K389I/R426C/P456L；64)D20V/Q89H/L156F/T187I/N226I/M321I/N326C/K381R/I406L；65)V75E/T164I/T187I/N226I/M285L/K324I/N326C/K381R；66)V75E/L156F/T164I/T187I/L258I/M285L/M321I/N326C/K381R/K389I/R426C；67)V75E/T164I/T187I/L258I/M285L/M321I/N326C/K381R/K389I/I406L/R426C；68)D20V/V75E/Q89H/T187I/L258I/M285L/M321I/N326C/K389I；69)T187I/N326C/K381R/K389I/P456L；70)T164I/T187I/N226I/M285L/N326C/R426C；71)D20V/V75E/Q89H/L156F/T187I/L258I/M285L/K324I/N326C；72)D20V/V75E/Q89H/T164I/T187I/Y204C/L258I/M285L/K324I/N326C；73)L156F/T164I/T187I/K324I/N326C/R426C；74)D20V/V75E/L156F/T164I/T187I/L258I/M321I/K324I/N326C/K381R/I406L；75)D20V/T187I/N226I/L258I/N326C/I406L；76)V75E/Q89H/L156F/T187I/M321I/K324I/N326C；77)L156F/T164I/T187I/K324I/N326C/K381R；78)L156F/T164I/T187I/L258I/K324I/N326C；79)D20V/V75E/Q89H/L156F/T187I/Y204C/L258I/M321I/N326C/K389I/I406L；80)T187I/M285L/N326C/I406L/R426C；81)T187I/N226I/N326C/K381R/P456L；82)D20V/T164I/T187I/Y204C/M285L/K324I/N326C/K389I/R426C；83)V75E/T187I/N326C/K381R/I406L；84)T187I/Y204C/N326C/K381R/K389I；85)T187I/N226I/L258I/M285L/M321I/N326C；86)D20V/L156F/T187I/M285L/M321I/K324I/N326C/K389I；87)D20V/L156F/T187I/Y204C/N326C/K389I/I406L/R426C；88)T164I/T187I/K324I/N326C/K389I/R426C；89)V75E/Q89H/T187I/M321I/K324I/N326C/I406L；90)V75E/T187I/L258I/N326C/K389I；91)D20V/V75E/L156F/T187I/N326C/K389I/I406L/R426C；92)D20V/Q89H/T164I/T187I/N226I/N326C/K389I/I406L；93)D20V/Q89H/L156F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【专利技术属性】
技术研发人员：吴边，刘洋，李瑞峰，张冬竹，刘志成，章晖，
申请(专利权)人：秦皇岛华恒生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13