本申请属于干细胞技术领域，具体涉及一种培养间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。本发明专利技术所提供的一种培养间充质干细胞的无血清培养基，包含：人血白蛋白、表皮细胞生长因子和干细胞生长因子。该培养基成分确定，可避免血清的抑制因子TGF‑b浓度不同和位置成分的干扰，减少过敏源；本发明专利技术利用干细胞生长因子的自身特性，使得该无血清培养基针对性很强，有利于促进间充质干细胞的增殖和维持其细胞干性。
A serum-free medium for culturing mesenchymal stem cells and its preparation method
The present application belongs to the field of stem cell technology, in particular to a serum-free medium for culturing mesenchymal stem cells and a preparation method thereof. The present invention provides a serum-free medium for culturing mesenchymal stem cells, which comprises human serum albumin, epidermal growth factor and stem cell growth factor. The determination of the composition of the medium can avoid the interference of the different concentration and location of the serum inhibitor TGF_b and reduce the allergens. The present invention utilizes the self-characteristics of the stem cell growth factor to make the serum-free medium highly targeted, and is beneficial to promoting the proliferation of mesenchymal stem cells and maintaining their cell dryness.
【技术实现步骤摘要】
一种培养间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种培养间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层的一类细胞，具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。来源于人羊膜的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，易于分离且分离细胞量大，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。目前的间充质干细胞培养基配方中含有人血清或者动物血清，血清中未知成分较多，甚至有可能包括一些未知的过敏源和病原体，一方面会干扰实验结果，另一方面是无法保证其所培养的细胞的安全性，无法应用于临床研究。本专利技术欲寻找一种效果显著，安全性高，适合培养临床应用的羊膜间充质干细胞的无血清培养基。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种培养间充质干细胞的无血清培养基，用于解决现有培养基安全性差、不适合应用于临床上培养羊膜间充质干细胞的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术一方面，提供了一种培养间充质干细胞的无血清培养基，包含：人血白蛋白、表皮细胞生长因子、干细胞生长因子和基础培养基。优选的，所述人血白蛋白的体积百分比浓度为2％～4％。优选的，所述表皮细胞生长因子的浓度为5～15ng/mL。优选的，所述干细胞生长因子的浓度为1～2mg/mL。优选的，所述基础培养基为低糖DMEM。优选的，所述干细胞生长因子为脐带间充质干细胞培养液的冻干粉；所述脐带间充质干细胞为第一代至第五代脐带间充质干细胞。另一方面，本专利技术还提供了上述无血清培养基的制备方法，将人血白蛋白、表皮细胞生长因子、干细胞生长因子和基础培养基混合，得到所述无血清培养基。又一方面，本专利技术还提供了一种培养间充质干细胞的方法，将间充质干细胞接种于上述无血清培养基或上述制备方法得到的无血清培养基中进行培养。本专利技术中，间充质干细胞优选为羊膜间充质干细胞，更优选为人羊膜间充质干细胞。优选的，所述培养的条件为37℃和体积浓度为5％的CO2。优选的，所述接种的细胞密度为5×104个/mL。本专利技术提供了一种培养间充质干细胞的无血清培养基，包含：人血白蛋白、表皮细胞生长因子和干细胞生长因子。该培养基成分确定，可避免血清的抑制因子TGF-b浓度不同和位置成分的干扰，减少过敏源；本专利技术利用干细胞生长因子地自身特性，使得该无血清培养基针对性很强，有利于促进羊膜间充质干细胞的增殖和维持其细胞干性。具体实施方式下面将结合本专利技术具体实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本专利技术的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神，均应涵盖在本专利技术保护的范围中。实施例1本实施例提供了一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其配方和制备过程如下：1、配方2、制备过程1)干细胞生长因子的制备取P2的人羊膜间充质干细胞，用含10％FBS的低糖DMEM进行稀释，然后按1×105～10×105cell/mL的细胞密度接种于培养瓶中，进行大规模的培养。当细胞生长融合度达80％以上时，以PBS清洗细胞两遍后换用1640选择培养基培养细胞，3天一换液，收集培养细胞的培养液。将培养液采用0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，得到一次滤液。采用0.22μm滤膜将一次滤液过滤除去3KDa以下小颗粒物质，得到二次滤液。采用Slice200切向流器进行浓缩二次滤液，循环过滤的时间为3h，浓缩液用冻干机制成冻干粉，得到本实施例的干细胞生长因子，待用。2)选择DMEM低糖作为基础培养基。3)取人血白蛋白，加入500mL的DMEM低糖，再依次加入浓度为1000ng/mL的表皮生长因子(EGF)和干细胞生长因子，混匀，得到无血清培养基，并置于4℃保存。使用时，将人羊膜间充质干细胞按5×104个/mL的细胞密度接种于上述无血清培养基中，并于37℃、5％CO2下进行培养，即可。实施例2本实施例提供了一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其配方和制备过程如下：1、配方2、制备过程1)干细胞生长因子的制备取P2的人羊膜间充质干细胞，用含10％FBS的低糖DMEM进行稀释，然后按1×105～10×105cell/mL的细胞密度接种于培养瓶中，进行大规模的培养。当细胞生长融合度达80％以上时，以PBS清洗细胞两遍后换用1640选择培养基培养细胞，3天一换液，收集培养细胞的培养液。将培养液采用0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，得到一次滤液。采用0.22μm滤膜将一次滤液过滤除去3KDa以下小颗粒物质，得到二次滤液。采用Slice200切向流器进行浓缩二次滤液，循环过滤的时间为3h，浓缩液用冻干机制成冻干粉，得到本实施例的干细胞生长因子，待用。2)选择DMEM低糖作为基础培养基。3)取人血白蛋白，加入500mL的DMEM低糖，再依次加入浓度为1000ng/mL的表皮生长因子(EGF)和干细胞生长因子，混匀，得到无血清培养基，并置于4℃保存。使用时，将人羊膜间充质干细胞按5×104个/mL的细胞密度接种于上述无血清培养基中，并于37℃、5％CO2下进行培养，即可。实施例3本实施例提供了一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其配方和制备过程如下：1、配方2、制备过程1)干细胞生长因子的制备取P2的人羊膜间充质干细胞，用含10％FBS的低糖DMEM进行稀释，然后按1×105～10×105cell/mL的细胞密度接种于培养瓶中，进行大规模的培养。当细胞生长融合度达80％以上时，以PBS清洗细胞两遍后换用1640选择培养基培养细胞，3天一换液，收集培养细胞的培养液。将培养液采用0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，得到一次滤液。采用0.22μm滤膜将一次滤液过滤除去3KDa以下小颗粒物质，得到二次滤液。采用Slice200切向流器进行浓缩二次滤液，循环过滤的时间为3h，浓缩液用冻干机制成冻干粉，得到本实施例的干细胞生长因子，待用。2)选择DMEM低糖作为基础培养基。3)取人血白蛋白，加入500mL的DMEM低糖，再依次加入浓度为1000ng/mL的表皮生长因子(EGF)和干细胞生长因子，混匀，得到无血清培养基，并置于4℃保存。使用时，将人羊膜间充质干细胞按5×104个/mL的细胞密度接种于上述无血清培养基中，并于37℃、5％CO2下进行培养，即可。测试例根据下表1，分别配制三种受试培养基，其中，A组培养基为实施例1的无血清培养基，B组培养基为现有技术中的常用培养基，C组培养基为空白对照组，其配方如表1所示：表1A组B组C组低糖DMEM低糖DMEM低糖DMEM3vol％人血白蛋白10％FBS10mg/mLEGF、1.5mg/mL干细胞生长因子取汇合度为80％的P1代的人羊膜间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，包含：人血白蛋白、表皮细胞生长因子、干细胞生长因子和基础培养基。
【技术特征摘要】
1.一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，包含：人血白蛋白、表皮细胞生长因子、干细胞生长因子和基础培养基。2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述人血白蛋白的体积百分比浓度为2％～4％。3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述表皮细胞生长因子的浓度为2～15mg/mL。4.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述干细胞生长因子的浓度为1～2mg/mL。5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为低糖DMEM。6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述干细胞生长因子为脐带间充...
【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，梁美乐，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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