一种超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法技术

本发明专利技术涉及一种超灵敏IL‑6荧光免疫层析测定试剂盒和测定方法。试剂盒由荧光微球标记的IL‑6单克隆抗体溶液和免疫层析试纸条组成，IL‑6单克隆抗体溶液包含特定浓度的荧光微球，抗体与荧光微球通过生物素‑亲和素偶联。本发明专利技术提供的测定方法，测定线性范围1.72～1000pg/mL,线性相关系数为0.997；灵敏度为1.72pg/ml；精密度平均CV

【技术实现步骤摘要】
一种超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法
本专利技术属于医药领域，涉及一种IL-6荧光免疫层析测定试剂盒及测定方法。
技术介绍
Il-6是一种多功能的细胞因子，可由体内多种细胞分泌产生，具有调节免疫应答、造血功能及急性期相反应。IL-6作为感染性疾病新的标志物，倍受临床关注和重视。当机体感染早期，IL-6率先升高,2小时达高峰，早于CRP和PCT，其升高水平与细菌感染严重程度密切相关。IL-6测定还可用于感染性疾病的预后判断，当IL-6>1000pg/mL时，提示预后不良；动态观察IL-6水平有助于了解感染性疾病的进展和患者对治疗的反应。血液中IL-6的含量很低(pg/mL),一般方法难于测定。目前常应用酶联免疫法、发光免疫法及荧光免疫层析法进行检测。酶联免疫法测定IL-6仅在科研中较常用；罗氏及西门子公司大型发光免疫分析仪有常规定量测定IL-6的项目,可为临床住院病人服务，但不适合门急诊及基层医院使用。专利申请号为CN105445466A的中国专利技术公开了一种白介素6的检测方法及其试剂盒，描述了一种用荧光胶乳微粒作探针测定IL-6的荧光免疫层析法,适合用于门急诊及基层医院,但该方法测定IL-6的灵敏度达不到要求，最低检测限仅为50pg/mL,而正常人参考值<7pg/mL,容易造成漏检误诊,使临床推广应用遇到问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种IL-6荧光免疫层析测定试剂盒和测定方法，达到超灵敏(IL-6≤2pg/mL)测定目标，本专利技术购买优质IL-6抗原；筛选了高效价的IL-6单克隆抗体；采用了生物素-亲和素放大系统；研究摸索了检测标本的最佳用量和反应检测时间。应用时间分辨荧光微球和量子点荧光微球作标记探针，建立了超灵敏IL-6荧光免疫层析测定方法。经方法学实验，该法灵敏度1.72pg/mL；精密度平均CV<10％；准确度平均回收率97.1％；测定线性范围1.72～1000pg/mL；干扰样本中血红蛋白浓度低于181.82mg/mL，甘油三脂浓度低于18.18mg/mL，胆红素浓度低于181.82ug/mL时，干扰样本测试结果偏差低于可接受范围的10％；用浓度为200pg/mL的IL-2、IL-4、IL-8、IL-12的样本在IL-6测试条上进行测试，不存在特异性干扰；临床样本检测结果与西门子公司大型发光免疫分析仪测定结果基本一致(r＝0.9914)，既保留了传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又加入了灵敏度高、稳定性好、受自然荧光干扰低等优点，同时其配套使用的设备精巧，适合医院门诊、急诊检验科使用。可广泛应用于基层医院及大医院门、急诊检验科，可以超灵敏定量测定血液中IL-6的浓度，检测时间短，操作流程简单，无需大型仪器设备。本专利技术提供了如下的技术方案：一种超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，包括免疫层析试纸条和荧光微球标记的IL-6单克隆抗体溶液，其中IL-6单克隆抗体溶液中包括荧光微球标记的IL-6单克隆抗体。优选的是，所述试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜设置在样品垫和吸水垫之间，硝酸纤维素膜上依次设置检测T线和质控C线。上述任一方案优选的是，所述T线上包被IL-6单抗，C线上包被羊抗鼠IgG，样本中的待测物质IL-6与IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球形成免疫复合物，再与T线的IL-6捕获抗体结合，未与T线反应的IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球最后与C线上的羊抗鼠IgG形成羊抗鼠IgG-IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球的免疫复合物。抗体与荧光微球通过生物素-亲和素偶联。上述任一方案优选的是，所述荧光微球分别是亲和素-时间分辨荧光微球、亲和素-量子点荧光微球中的至少一种。这两种都可以作为标记探针偶联IL-6单克隆抗体，且检测效果相同。上述任一方案优选的是，所述T线上IL-6单克隆抗体包被浓度是0.5mg/ml，C线上羊抗鼠IgG包被浓度为1.0mg/ml。上述任一方案优选的是，IL-6单克隆抗体溶液包含荧光微球标记的IL-6单克隆抗体和特殊配制的微球保存液。荧光微球在微球保存液中可以长时间(>1年)保存且处于工作状态。上述任一方案优选的是，所述荧光微球标记的IL-6单克隆抗体浓度范围是0.1-1.0mol/L。上述任一方案优选的是，所述荧光微球标记的IL-6单克隆抗体溶液制备方法包括以下步骤：(1)使用生物素标记IL-6抗体并洗去多余未标记的生物素，取亲和素-荧光微球稀释至0.1-1.0％，混匀后加入标记生物素的IL-6单抗中，混合均匀后室温反应10-30分钟；(2)加入0.5-2％BSA溶液，封闭反应0.5-2小时；(3)使用PBS缓冲液清洗，再加入荧光微球保存液重悬，即得到IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球，置2-8℃保存。上述任一方案优选的是，亲和素-荧光微球是亲和素-时间分辨荧光微球、亲和素-量子点微球中的至少一种。上述任一方案优选的是，所述免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：(1)采用三维点膜喷金仪，将IL-6单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线T线和质控线C线，T线上包被IL-6单抗，C线上包被羊抗鼠IgG；(2)在干燥箱中干燥后，将样本垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC粘性底板组装；(3)切割成试纸条，加干燥剂于常温下密封保存。本专利技术还提供一种采用上述的试剂盒进行IL-6荧光免疫层析测定方法，包括以下步骤；(1)将IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球稀释到工作浓度，用10mM的PBS缓冲液将IL-6标准品稀释形成系列梯度浓度的标准品，取标准品溶液，加入到层析试纸条的样本孔中，再加入荧光微球工作溶液，反应后，读取NC膜上T，C线荧光信号并计算比值T/(T+C)，将标准品溶液的浓度进行对数转换后与比值进行线性拟合，得到标准品拟合曲线；(2)将待测样本加入测试条的样本孔中，再加入荧光微球工作溶液，反应15分钟后，使用干式免疫荧光分析仪读取NC膜上T，C线荧光信号并计算比值T/(T+C)，将比值代入到标准品拟合曲线，计算出样本中IL-6的浓度。优选的是，所述步骤(1)中用10mM的PBS缓冲液将IL-6标准品稀释成1000、500、250、100、50、25、10、5、2pg/ml。本专利技术的超灵敏IL-6荧光免疫层析测定方法原理：本专利技术采用双抗体夹心法进行检测。在层析膜上T线用IL-6捕获抗体划线，C线用兔抗鼠IgG划线。检测时，同时加入样本与IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球，样本中的待测物质IL-6与醋酸纤维素膜上T线的IL-6捕获抗体结合，再与IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球形成免疫复合物。未与T线反应的IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球，与C线上的兔抗鼠IgG形成兔抗鼠IgG-IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球的免疫复合物。在365nm波长激发光照射下，荧光微球发出620nm左右波长的荧光。T线上荧光的强度与待测样本中IL-6的含量成正比。根据标准品曲线，可以计算出待测样本中IL-6的含量。有益效果(1)本专利技术通过构建IL-6抗原和制备IL-6单克隆抗体,研制了相关试剂盒,建立了IL-6荧光免疫层析测定方法。试剂盒由荧光微球标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超灵敏IL‑6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：包括免疫层析试纸条和荧光微球标记的IL‑6单克隆抗体溶液，其中IL‑6单克隆抗体溶液中包含荧光微球标记的IL‑6单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：包括免疫层析试纸条和荧光微球标记的IL-6单克隆抗体溶液，其中IL-6单克隆抗体溶液中包含荧光微球标记的IL-6单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述试纸条包括底板、样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜设置在样品垫和吸水垫之间，硝酸纤维素膜上依次设置检测T线和质控C线。3.根据权利要求2所述的IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述T线上包被IL-6单抗，C线上包被羊抗鼠IgG，样本中的待测物质IL-6与IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球形成免疫复合物，再与T线的IL-6捕获抗体结合，未与T线反应的IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球最后与C线上的羊抗鼠IgG形成羊抗鼠IgG-IL-6单抗-生物素-亲和素-荧光微球的免疫复合物。4.根据权利要求1所述的超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述荧光微球分别是亲和素-时间分辨荧光微球、亲和素-量子点微球中的至少一种。5.根据权利要求1所述的超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述IL-6单克隆抗体溶液包含荧光微球标记的IL-6单克隆抗体和特殊配制的微球保存液。6.根据权利要求1所述的超灵敏IL-6荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于：所述荧光微球标记的IL-6单克隆抗体溶液制备方法包括以下步骤：(1)使用生物素标记IL-6抗体并洗去多余未标记的生物素，取亲和素-荧光微球稀释至0.1-1.0％，混匀后加入标记生物素的IL-6单抗中，混合均匀后室温反应10-30分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张乐之，余铭恩，胡祥叶，王立童，李丹，吴滨，
申请(专利权)人：杭州康知生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33