一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和应用技术

本发明专利技术采用犬异体脂肪干细胞制备治疗犬慢性肾病制剂，本发明专利技术的脂肪干细胞提取方法包括：获得犬腹腔脂肪组织、消化过滤离心、红细胞裂解液重悬、P0～P3代细胞培养。将得到的P3代的脂肪干细胞进行表面抗原检验，筛选出CD29、MHC‑I表达大于70％，且CD34、CD45表达小于2％，分化潜能高，能成脂、成骨、成软骨且染色体无异常，内毒素为阴性，支原体未检出的脂肪干细胞，以1×10

Extraction of canine adipose stem cells and its preparation and Application

The present invention adopts canine allogeneic adipose stem cells to prepare a preparation for treating canine chronic kidney disease. The extraction method of adipose stem cells includes obtaining canine abdominal adipose tissue, digestion, filtration, centrifugation, suspension of erythrocyte lysate, P 0-P 3 generation cell culture. The expression of CD29 and MHC_I was more than 70%, and the expression of CD34 and CD45 was less than 2%. The adipose stem cells with high differentiation potential, fat, osteogenesis, cartilage formation and chromosome abnormality were screened out. Endotoxin was negative. Adipose stem cells without mycoplasma detection were 1 x 10.

【技术实现步骤摘要】
一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和应用
本专利技术涉及干细胞制备治疗疾病的制剂领域。具体的，本专利技术提供了一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和在制备异体脂肪干细胞治疗犬慢性肾病的制剂中的用途。
技术介绍
肾脏是动物内重要的实质性脏器，担负着排泄代谢废物、调节水电解质酸碱平衡、内分泌的重要功能。但由于其自身结构的复杂性，在受到急性或慢性因素的作用后常会造成肾脏不可逆性损伤，从而逐渐发展至慢性肾功能衰竭。慢性肾病(Chronickidneydisease，CKD)，是以造成动物永久性肾损伤为主要特征的慢性疾病，属于广义范围的疾病。动物单一或双个肾脏存在持续的(3个月以上)结构和功能异常，从单一肾脏轻微的结构病变到大量的肾元损失而影响到双侧肾脏，则可被定义为CKD。CKD在宠物临床中多发于老年犬猫，主要的症状是由肾脏损伤引起的贫血、电解质紊乱和脱水等并发症，最终动物会因并发症而死亡。CKD对肾脏的损伤是不可逆且无法预防的，需要一个长期的治疗过程。CKD根据病因分为两类：先天性和后天性的。先天性肾脏疾病的病因是动物先天性的肾脏病变(如再生障碍性贫血)或者具有将来会导致肾脏疾病的潜能(如多囊肾病)。虽然大多数先天性肾病的病例被认为是遗传的，但遗传传递和发病机制的模式仍不明。后天性CKD是肾实质损害导致肾单位丧失和肾功能逐渐衰退的结果。虽然在某些情况下，有可能确定和治疗肾脏疾病的根本原因(如肾盂肾炎)，但在大多数情况下，无法发现最初损害的性质。干细胞是一类未分化细胞，具有自我复制、自我更新、多向分化潜能等特性。脂肪间充质干细胞((Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是其中一种成体干细胞，因其具有取材容易，增殖能力强，生物学特性稳定，可以跨胚层分化，低免疫源性等优点，被广泛应用于多种疾病的治疗研究中，具有良好的临床应用前景。最近研究发现脂肪间充质干细胞可向肾实质细胞转化，参与受损肾脏组织修复，减轻肾脏损害的程度，具有肾脏保护作用。现在用于治疗犬慢性肾病的干细胞制剂的干细胞主要来源于患犬自体，这意味着需要对患犬进行全身麻醉手术采取脂肪组织，且需要一定周期来培养扩增，不仅对患病动物的损伤大，往往还会延误最佳治疗时期，且成本昂贵。
技术实现思路
为解决目前对慢性肾病患犬的治疗中，采用自体干细胞治疗所带来的对患犬机体损伤大，制剂制备周期长，且成本昂贵的问题，本专利技术采用犬异体脂肪干细胞制备治疗犬慢性肾病制剂，具体提供了一种犬异体脂肪干细胞的提取方法，另一个方面，本专利技术提供了一种犬异体脂肪干细胞制剂，再一个方面，本专利技术还提供了在制备异体脂肪干细胞治疗犬慢性肾病的制剂中的应用。利用本专利技术制备的异体脂肪干细胞具有低免疫反应风险，残留低等优点。本专利技术提供的异体脂肪干细胞能够有效地治疗犬慢性肾病。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种犬脂肪干细胞的提取方法，所述包括以下步骤：步骤1：获得犬腹腔脂肪组织，去除包绕脂肪组织的非脂肪组织，用PBS冲洗处理后的脂肪组织并剪碎；步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中；步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO2及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养不超过4天，每2～3天更换培养基；在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞。进一步的，步骤1所述的犬腹腔脂肪组织为腹膜脂肪和/或卵巢双侧脂肪，所述非脂肪组织为血管和/或筋膜。进一步的，步骤1具体为：无菌条件下手术摘取成年母犬双侧卵巢和/或腹膜上面附着的脂肪组织，用眼科镊子剥除包绕脂肪组织的筋膜和/或血管，在PBS中清洗脂肪组织，去除血污。进一步的，本专利技术的犬异体脂肪组织的提取方法还包括步骤9：对所述P3代的脂肪干细胞进行表面抗原检验、分化潜能鉴定、内毒素实验和支原体检查，筛选出表面抗原CD29、MHC-I表达都大于70％，并且表面抗原CD34、CD45表达都小于2％；分化潜能高，能成脂、成骨、成软骨且染色体无异常；且无菌，内毒素、支原体检测阴性的P3代脂肪干细胞。表面抗原检验和筛选指标，说明本专利技术提取到的细胞符合脂肪干细胞的表面抗原特征，且免疫原性弱；分化潜能鉴定指标，和内毒素实验及支原体检查指标，说明本专利技术提取的P3代脂肪干细胞分化潜能高且符合注射要求。本专利技术将提取到的脂肪干细胞进行其特定表面抗原检验，分化潜能鉴定以及内毒素实验及支原体检查，采用三重指标的筛选，确保本专利技术提取的犬异体脂肪干细胞能用于制备治疗脂肪干细胞制剂，并能够用于治疗与干细胞来源犬体不同的犬体所患的慢性肾病，保证制剂的安全性和有效性。本专利技术的第二个目的是提供一种犬脂肪干细胞制剂，所述脂肪干细胞制剂包括前述提取方法步骤9检查筛选的犬异体脂肪干细胞。进一步的，所述犬脂肪干细胞来源为经过健康筛查的供体成年犬的，非患病犬自身的脂肪干细胞。进一步的，所述犬异体脂肪干细胞制剂含有的犬异体脂肪干细胞的治疗剂量为1×106细胞/kg～5×106细胞/kg，所述剂量是指每千克(kg)重量的患病犬给予的犬异体脂肪干细胞的个数。进一步的，以前述提取方法步骤9检查筛选的脂肪干细胞为原料，按照病例所需剂量(1×106细胞/kg～5×106细胞/kg)，用0.5mL～1.0mL生理盐水重悬，吹打均匀后形成细胞悬液，把细胞悬液转移至注射器中，来回推挤直至充分混匀，制作成注射针剂。本专利技术的第三个目的是提供前述的犬异体脂肪干细胞提取方法或前述的犬异体脂肪干细胞制剂在制备治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂中的应用。进一步的，所述治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂为单独使用或与犬慢性肾病常规疗法联合使用。本专利技术有益效果在于：本专利技术的犬脂肪干细胞(ADSCs)提取方法，(1)分离方法简单，细胞活力强，容易大量扩增。(2)采用红细胞裂解液重悬细胞，处理时间2～5min，有助于提高收获的脂肪干细胞的纯度，进一步减少后面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述包括以下步骤：步骤1：获得犬腹腔脂肪组织，去除包绕脂肪组织的非脂肪组织，用PBS冲洗处理后的脂肪组织并剪碎；步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中；步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO2及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养不超过4天，每2～3天更换培养基；在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种犬脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述包括以下步骤：步骤1：获得犬腹腔脂肪组织，去除包绕脂肪组织的非脂肪组织，用PBS冲洗处理后的脂肪组织并剪碎；步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中；步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO2及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养不超过4天，每2～3天更换培养基；在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×103个/cm2密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞。2.根据权利要求1所述的犬脂肪组织的提取方法，其特征在于，步骤1所述的犬腹腔脂肪组织为...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖晓云，张海彬，吴文达，文依信，唐卓丰，汪恒，
申请(专利权)人：南京农业大学，威盛医疗技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32