安徽白山羊的X精子分离方法技术

本发明专利技术提供了一种安徽白山羊X精子分离方法，包括：对采集的精液进行液化；对液化后的精液进行孵化；在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的精液进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X精子。本发明专利技术的方法能够有效地对X精子进行分离，进而对后代的性别进行有效地选择。

Separation of X-sperm from Anhui White Goats

The invention provides a sperm separation method for Anhui white goat X, which includes: liquefying the collected semen; incubating the liquefied semen; adding 80%, 60% and 40% Percoll solution in the centrifugal tube in turn to obtain a density gradient centrifugal tube; taking the hatched semen for centrifugation, pouring out the supernatant, suspending it again with PBS solution and moving it to the top of the density gradient centrifugal tube. After centrifugation, the suspension of the lowest layer of density gradient centrifuge tube was absorbed to obtain separated X sperm. The method of the invention can effectively separate X sperm and effectively select the sex of offspring.

【技术实现步骤摘要】
安徽白山羊的X精子分离方法
本专利技术涉及山羊的X精子分离方法。
技术介绍
安徽白山羊属肉皮兼用型羊，是在暖温带半温润气候条件经过长期选育而形成的地方品种，分布于安徽省皖北地区和江淮之间北部，是黄淮山羊的一个地方群，在安徽省分布较广。该品种以性早熟、繁殖力高、板皮质量好而著称，但其个体小、生长速度慢，故作为肉羊生产。安徽白山羊体质结实，结构匀称，肉质鲜美、皮张质量好，是优良的地方畜牧品种。但是该品种繁殖率不高，扩繁速度不够快。因此，挑选X精子，提高后代母羊比例具有非常重要的意义。精子分离术是由美国遗传与辅助生育研究所精子分离部的研究员专利技术的一种技术，使得妊娠前可以选择胎儿性别。关于动物的精子分离方法和应用，国外学者做了大量研究，有白蛋白梯度游动分离法、精子表面抗原免疫学分离法、自由电泳分离法、遗传学分离法、精子差异膜蛋白分离法、流氏细胞仪分离法等。Lush试图利用精子的密度差异,通过离心分离精子的方法控制兔子后代的性别,结果不理想。此后,大多数分离精子的研究都通过“物理分离法”进行,以X和Y精子之间存在的细微物理差异(密度、电荷、运动特性等)为依据进行分离。Schilling等使用沉降下层的精液部分给母牛授精,得到70％雌性率；Ericsson等报道用白蛋白柱法分离Y精子,其分离率达到85％,人工授精后男婴出生率为79％；铃木达行用梯度离心法分离牛的精子,用分离的X精子层授精后到77.18％的母犊；Cardon电泳分离兔精液时,用阳极精液授精,仔兔中有74.13％的雌性率等。但以上方法重复性差,不同试验之间存在很大的差异(甚至得到相反的结果),不足以指导生产。真正让人们看到希望的性别控制方法是近10多年出现的流式细胞仪分离精子的方法。此法在国外已用于畜牧业生产中,并产生了很好的效益,国内近年也有研究和少量使用,前景良好。经过染色后的精子通过流式细胞仪时，由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成了包含单个X精子或者Y精子的微小液滴，高速射出喷嘴后逐个与激光交截。精子上的荧光染料Hoechst33342被氩离子紫外激光(～350nm)激发会产生蓝色激发光(～460nm)。由于X精子所含有DNA比Y精子多，结合上比较多的Hoechst33342，所激发出的荧光的强度就比Y精子强。蓝色激发光被正、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号，同时将接受到的信号传入主控机，其根据荧光强度的差别分辨出哪个是X精子，哪个是Y精子。同时，给被判别的包含单个X精子或者Y精子的微小液滴加载正电荷或者负电荷。携带正电荷或者负电荷精子的液滴在电场力的引导下，分别落入不同的收集容器中，X精子和Y精子得以分离。1989年美国XY公司首次应用流式细胞仪成功将XY精子分离，并达到一定的精确度，自此以后，经过11年的不断技术更新和开发，该项技术从2000年开始从实验室成功进入商业化生产应用，至今已利用分离X精子对10787头青年母牛进行了人工授精，受孕率达到53％。XY精子分离方法已应用于牛、马等哺乳动物。上述这些方法都存在着所需设备昂贵，难以在普通繁殖场推广的特点。因此需要专利技术一种新的简单有效的X精子分离方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单有效的X精子分离方法。本专利技术提供了一种X精子分离方法，包括：对采集的精液进行液化；对液化后的精液进行孵化；在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的精液进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X精子。在上述X精子分离方法中，其中，对采集的精液进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。在上述X精子分离方法中，其中，对液化后的精液进行孵化包括：用移液管取1mL液化后的精液，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液，试管倾斜45度，放于CO2培养箱，孵化35min。在上述X精子分离方法中，其中，在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液包括在10ml离心管内依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液各2ml。在上述X精子分离方法中，其中，取孵化后的精液进行离心包括：从放于CO2培养箱孵化的试管的刻度0和刻度2之间，吸取2ml精液悬液，1000r/min离心8min。在上述X精子分离方法中，其中，用PBS溶液重悬包括用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬。在上述X精子分离方法中，其中，在移入所述密度梯度离心管的最上层之后，250r/min离心30min，之后吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液。在上述X精子分离方法中，还包括：在吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液之后，1000r/min离心8min，之后用预热至37℃的PBS溶液调整精子密度至7500万/mL。本专利技术的方法能够有效地对X精子进行分离，进而对后代的性别进行有效地选择。附图说明图1示出了本专利技术分离的X精子与未经分离的精子授精后得到的后代性别的结果图。具体实施方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下面详细描述精子的选择与结果验证流程。1.采精种公羊选择与管理1.1种公羊的选择。种公羊应选择个体等级优秀，符合种用要求，年龄在2岁～5岁龄，体质健壮、睾丸发育良好、性欲旺盛的种羊。正常使用时，精子的活力在0.7～0.8，畸形精子少，正常射精量为0.8毫升～1.2毫升，密度中等以上。1.2种公羊的管理。放牧饲养时，要选派责任心强、有放牧经验的放牧员放牧，每天的放牧距离不少于7.5千米。种公羊要单独饲养，圈舍宽敞、清洁干燥、阳光充分、远离母羊圈舍。饲料应多样化，保证青绿饲料和蛋白质饲料的供给。配种季节，每天保证喂给2个～3个新鲜的鸡蛋(带壳喂给)。1.3种公羊采精调教。有些初次配种的公羊，采精时可能会遇到困难，此时可采取以下方法进行调教：一是观摩诱导法。即在其他公羊配种或采精时，让被调教公羊站在一旁观看，然后诱导它爬跨。二是睾丸按摩法。即在调教期每日定时按摩睾丸10分钟～15分钟，经几天后则会提高公羊性欲。三是发情母羊刺激法。用发情母羊做台羊，将发情母羊阴道黏液或尿液涂在公羊鼻端，刺激公羊性欲。四是药物刺激法，即对性欲差的公羊，隔日每只注射丙睾丸素1毫升～2毫升，连续注射3次后可使公羊爬跨。2.采精前的准备2.1选择发情好的健康母羊作台羊，后躯应擦干净，头部固定在采精架上。2.2种公羊在采精前，用湿布将包皮周围擦干净。2.3假阴道的准备：将消毒过的、酒精完全挥发后的内胎，用生理盐水棉球或稀释液棉球从里到外擦拭，在假阴道一端扣上消过毒并用生理盐水或稀释液冲洗后甩干的集精瓶(温度低于25℃时，集精瓶夹层内要注入30～35℃温水)。在外壳中部生水孔注入150毫升左右的50～55℃温水，拧上气卡塞，套上双连球打气，使假阴道的采精口形成三角形，并拧好气卡。最后把消毒好的温度计插入假阴道内测温，温度在39～42℃，在假阴道内胎的前1/3，涂抹稀释液或生理盐水作润滑剂，就可立即用于采精。3.采精3.1安装好假阴道并使其内部温度适当。3.2将发情旺盛的母羊保定在采精架内。3.3一切准备就绪后，再将公羊赶至采精场本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种安徽白山羊X精子分离方法，包括：对采集的精液进行液化；对液化后的精液进行孵化；在离心管中依次加入质量百分数为80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的精液进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X精子。

【技术特征摘要】
1.一种安徽白山羊X精子分离方法，包括：对采集的精液进行液化；对液化后的精液进行孵化；在离心管中依次加入质量百分数为80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的精液进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X精子。2.根据权利要求1所述的X精子分离方法，其中，对采集的精液进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。3.根据权利要求1所述的X精子分离方法，其中，对液化后的精液进行孵化包括：用移液管取1mL液化后的精液，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液，试管倾斜45度，放于CO2培养箱，孵化35min。4.根据权利要求1所述的X精子分离方法，其中，在离心管中依次加入80％、6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈德宇，朱茂英，辛洪雷，辛洪飞，辛红忠，辛颖，庞彬，
申请(专利权)人：临泉县欣达生态羊业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34