一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法技术

本发明专利技术公开了一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法，包括以下步骤：S1、猪角膜的预处理；S2、进入飞秒激光机交互界面后根据术前测量的猪角膜厚度值设定飞秒激光的手术参数，激光精确聚集于设定的角膜面后，压平，进行激光爆破、气化切割，完成角膜后板层植片的制作，厚度为100μm，直径为8.5mm的带有后弹力层的角膜内皮片；S3、通过溶胀、反复冻融、振摇、风干等物理方法进行脱细胞操作；S4、猪角膜内皮植片的制备。本发明专利技术利用瞬间的激光爆破技术使其能够完成角膜精准的切割，在降低猪角膜基质片的免疫原性的同时还能制备超薄的带有后弹力层的猪角膜内皮植片，大大降低了由厚度不均造成的移植困难。

A femtosecond laser assisted preparation of porcine corneal endothelial grafts

The invention discloses a method for assisting the preparation of porcine corneal endothelial grafts by means of femtosecond laser technology, which comprises the following steps: pretreatment of S1 and pig corneas; S2, after entering the femtosecond laser interface, the operation parameters of femtosecond laser are set according to the thickness of the pig corneas measured before operation, and the laser is precisely gathered on the set cornea surface to flatten, and laser blasting and gasification cutting are completed. The posterior lamellar graft was made of corneal endothelium with a thickness of 100 m and a diameter of 8.5mm with a posterior elastic layer. S3 was used for the decellularized operation by swelling, repeated freezing and thawing, shaking and air drying. S4 and porcine corneal endothelial grafts were prepared. The invention uses instantaneous laser blasting technology to make the cornea precise cutting, reduces the immunogenicity of the pig cornea matrix, and can prepare ultrathin porcine corneal endothelial grafts with posterior elastic layer, which greatly reduces the difficulty of transplant caused by uneven thickness.

【技术实现步骤摘要】
一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法
本专利技术涉及角膜内皮片制备领域，具体涉及一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法。
技术介绍
近年来，组织工程(TE)角膜取得了重大进展，由于它能够很大程度减轻器官衰竭和移植供体器官短缺的问题而备受关注，由于人类角膜内皮细胞损伤后不能修复，因此而如何在体外建立一个角膜内皮细胞组织且能够行使类似角膜内皮细胞的生物学功能来治疗内皮盲患者显得尤为重要。角膜内皮移植术是用健康供体组织替换病变内皮是已经被广泛认为是治疗角膜内皮营养不良的唯一有效的选择，目前来说，无论是穿透性角膜移植术，还是DSEK，DMEK等手术方式的改进都需要提供角膜供体，不能从根本上解决供体短缺的问题，而近几年来内皮细胞移植成为研究热点，自体细胞或者同种异体细胞体外培养取得了重大的进展。随着屈光手术的迅速发展及普及，也使得未来可能的角膜材料供体的质量不能得到保证，由于供体移植物的质量的不稳定、移植术后的免疫排斥反应或内皮代谢失调等等最终导致角膜移植的失败率达到18％以上，而脱细胞猪角膜基质免疫原性非常低，能够很好的保留了原始角膜缘细胞外基质微环境，APCM已经被证实它的生物力学特性是适用于作为组织工程支架的选择之一的，它能够提供了角膜组织的大部分功能，致密排列的胶原蛋白带来的强度、韧性以及组织相容性都使它成为组织工程中多数研究者关注的的焦点，因此我们选择猪角膜基质来作为本实验细胞移植载体。同时，在另一方面，飞秒激光辅助缝合前板层角膜移植治疗浅表的角膜疾病被证实是安全有效的，且患者在术后能够获得较好的视觉效果，不仅在屈光领域，飞秒激光辅助角膜移植术也是得到重大的发展，由于在细胞培养及接种等的操作过程本身就极易导致角膜内皮细胞的脱落，相比人工切削的方式制备APCM，飞秒辅助制备的APCM术前可以通过精确的测量角膜厚度来确定所需要的切削厚度和层面，使得表面更加平滑，对下一步的移植来说也能够尽可能接近角膜本身的特性，降低由于植片厚度不均带来的移植困难和术后眼压测量失真、术后散光等等影响。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法，包括以下步骤：S1、猪角膜的预处理：取透明猪角膜用含有双抗的PBS反复冲洗及浸泡，挑选角膜上皮完整且无划痕的猪眼，常规使用裂隙灯观察眼前段，corvis角膜生物力学分析仪和眼前节0CT测量中央角膜厚度测量，角膜地形图检查角膜曲率；S2、飞秒激光辅助制备角膜内皮片进入飞秒激光机交互界面后根据术前测量的猪角膜厚度值设定飞秒激光的手术参数，激光精确聚集于设定的角膜面后，压平，进行激光爆破、气化切割，完成角膜后板层植片的制作，厚度为100μm，直径为8.5mm的带有后弹力层的角膜内皮片；S3、脱细胞猪角膜内皮片的制备在无菌条件下，将制备的角膜内皮片迅速转移到实验室，放置在含有双抗的无菌水中4℃溶胀12h，-80℃冰冻1h，37℃水浴锅融化30min，重复冻融3次充分溶胀组织后，0.5％SDS离心管4℃下振摇24h，无菌水漂洗至少3次后，内皮面朝上置于超净工作台上风干，紫外消毒灭菌12小时，冻干，得脱细胞猪角膜内皮片，备用；S4、猪角膜内皮植片的制备：将脱细胞猪角膜内皮片平铺于24孔培养板中，加入含有5％胎牛血清的DMEM培养基复水，浸没，培养箱过夜，次日可见角膜内皮片肿胀，吸尽培养基，加入新鲜配置的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，即猪角膜内皮植片的制备完成。所述步骤S3中所有配置的溶液中为避免污染均加入双抗液：200u/ml青霉素和200u/链霉素液。本专利技术具有以下有益效果：利用瞬间的激光爆破技术使其能够完成角膜精准的切割，所得到的角膜内皮片更薄，大大降低了由厚度不均造成的移植困难，术后测量眼压失真、术后散光等并发症。同时飞秒激光辅助制备的超薄猪角膜内皮植片能够体现良好的生物相容性，适合广泛推广和投入使用。本专利技术不同于其他脱细胞猪角膜基质，在取材时我们保留了猪角膜后弹力层，文献证明后弹力层是细胞贴附生长良好的支架，目前国内上市的脱细胞猪角膜基质仅仅只能用于板层移植，而对于内皮病变的患者来说不能解决致盲问题，而带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质片则能够在体外构建组织工程角膜治疗内皮盲患者有着重要作用。本专利技术通过溶胀、反复冻融、振摇、风干等物理方法进行脱细胞操作，能够在完整保存角膜基质胶原的本身还能够大大降低其免疫原性，同时，飞秒激光辅助下制备的猪角膜内皮植片更薄，体外培养时浸泡在培养基中较传统角膜刀取材的水肿程度更轻，更利于种植培养和显微镜下观察。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1S1、取透明猪角膜用含有双抗的PBS反复冲洗及浸泡，挑选角膜上皮完整无划痕的猪眼，放置冰盒中保存，常规使用裂隙灯观察眼前段，corvis角膜生物力学分析仪，眼前节0CT测量中央角膜厚度测量，角膜地形图检查角膜曲率。S2、进入飞秒激光机交互界面设定加工参数，激光精确聚集于设定的角膜面后，压平，进行激光爆破，激光爆破后，在角巩膜缘取一约3mm手术切口，将带有后弹力层的角膜内皮层100-200um厚度的角膜片取出，无菌条件下迅速转移至实验室；S3、将制备的角膜片放置含有双抗的无菌水中4℃溶胀12h，-80℃冰冻1h，37℃水浴锅融化30min，重复冻融3次充分溶胀组织；0.5％SDS离心管4℃下振摇24h，无菌水漂洗至少3次后，将带有后弹力层的APCM的内皮面朝上置于超净工作台上风干，紫外消毒灭菌12小时后冻干备用，其中，所有配制液中为避免污染均加入双抗液。S4、将脱细胞猪角膜内皮片平铺于24孔培养板中，加入含有5％胎牛血清的DMEM培养基复水，至少要浸没过植片，培养箱过夜，次日可见角膜内皮片肿胀，吸尽培养基后，重新加入新鲜配置的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，猪角膜内皮植片的制备完成。以上对本专利技术的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本专利技术并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本专利技术的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、猪角膜的预处理：取透明猪角膜用含有双抗的PBS反复冲洗及浸泡，挑选角膜上皮完整且无划痕的猪眼，使用裂隙灯观察眼前段，corvis角膜生物力学分析仪和眼前节0CT测量中央角膜厚度测量，角膜地形图检查角膜曲率；S2、飞秒激光辅助制备角膜内皮片进入飞秒激光机交互界面后根据术前测量的猪角膜厚度值设定飞秒激光的手术参数，激光精确聚集于设定的角膜面后，压平，进行激光爆破、气化切割，完成角膜后板层植片的制作，，厚度为100μm，直径为8.5mm的带有后弹力层的角膜内皮片；S3、脱细胞猪角膜内皮片的制备在无菌条件下，将制备的角膜内皮片迅速转移到实验室，放置在含有双抗的无菌水中4℃溶胀12h，‑80℃冰冻1h，37℃水浴锅融化30min，重复冻融3次充分溶胀组织后，0.5％SDS离心管4℃下振摇24h，无菌水漂洗至少3次后，内皮面朝上置于超净工作台上风干，紫外消毒灭菌12小时，冻干，得脱细胞猪角膜内皮片，备用；S4、猪角膜内皮植片的制备：将脱细胞猪角膜内皮片平铺于24孔培养板中，加入含有5％胎牛血清的DMEM培养基复水，浸没，培养箱过夜，次日可见角膜内皮片肿胀，吸尽培养基，加入新鲜配置的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，即猪角膜内皮植片的制备完成。...

【技术特征摘要】
1.一种飞秒激光技术辅助制备猪角膜内皮植片的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、猪角膜的预处理：取透明猪角膜用含有双抗的PBS反复冲洗及浸泡，挑选角膜上皮完整且无划痕的猪眼，使用裂隙灯观察眼前段，corvis角膜生物力学分析仪和眼前节0CT测量中央角膜厚度测量，角膜地形图检查角膜曲率；S2、飞秒激光辅助制备角膜内皮片进入飞秒激光机交互界面后根据术前测量的猪角膜厚度值设定飞秒激光的手术参数，激光精确聚集于设定的角膜面后，压平，进行激光爆破、气化切割，完成角膜后板层植片的制作，，厚度为100μm，直径为8.5mm的带有后弹力层的角膜内皮片；S3、脱细胞猪角膜内皮片的制备在无菌条件下，将制备的角膜内皮片迅速转移到实验室，放置在含有双抗的无菌水中4℃溶胀1...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国富，肖国蓓，崔雯雯，
申请(专利权)人：黄国富，肖国蓓，
类型：发明
国别省市：江西,36