前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒。试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明专利技术所述试剂盒检测患者是否存在SLC26A4基因c.368C>T突变，从而诊断前庭导水管扩大/Pendred综合征发生的原因，该试剂盒将有利于临床上开展前庭导水管扩大/Pendred综合征患者的SLC26A4突变筛查工作，为前庭导水管扩大/Pendred综合征患者的诊断提供依据。

Detection Kit for SLC26A4 Mutation in Pathogenic Gene of Vestibular Aqueduct Enlargement/Pendred Syndrome

The invention discloses a mutation detection kit for the pathogenic gene SLC26A4 of vestibular aqueduct enlargement/Pendred syndrome. The kit includes reagents for extracting DNA from the sample to be tested, PCR reaction reagents for amplifying the sample DNA, and reagents for sequencing the amplified products of the PCR. The PCR reaction reagents for amplifying the sample DNA include PCR primers. The kit can be used to detect the c.368C>T mutation of the SLC26A4 gene in patients, thereby diagnosing the cause of the occurrence of vestibular aqueduct enlargement/Pendred syndrome. The kit will be helpful for clinical screening of SLC26A4 mutation in patients with vestibular aqueduct enlargement/Pendred syndrome, and provide a basis for the diagnosis of patients with vestibular aqueduct enlargement/Pendred syndrome.

【技术实现步骤摘要】
前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断前庭导水管扩大/Pendred综合征中应用的SLC26A4基因单个突变位点c.368C>T(p.P123L)分型检测试剂盒。
技术介绍
1997年Everett首先报道Pendred综合征的致病基因为SLC26A4基因。Pendred综合征表现为先天性的感音神经性耳聋，耳蜗畸形(前庭导水管扩大或Mondini畸形)合并甲状腺肿大，它的遗传方式为常染色体隐性遗传。1999年Usami在6个单纯前庭导水管扩大家庭(无甲状腺肿，无Mondini畸形)内进行SLC26A4基因全序列筛查，发现有4名患者为SLC26A4基因纯合或复合杂合突变，认为SLC26A4基因同样可以导致单纯前庭导水管扩大。2001年Campbell在6个前庭导水管扩大家系和5个Mondini畸形家系中各发现5名和4名患者存在SLC26A4基因突变，认为SLC26A4基因是颞骨畸形最主要的致病原因。由此，学者普遍认为SLC26A4基因突变可以导致Pendred综合征、单纯前庭导水管扩大或者合并内耳畸形的前庭导水管扩大。前庭导水管扩大是最常见的内耳畸形。临床表现为学语前感音神经性或混合型耳聋，有时呈波动性或渐进性。其波动性常与头部外伤、感冒有关，可伴有或不伴有眩晕。SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含有21个外显子，开放阅读框起始于2号外显子，全长2343bp，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin，主要分布于甲状腺、内耳和肾脏。Pendrin相对分子量86000，具有11个跨膜区域，5个细胞外环，5个细胞内环，胞内氨基末端和胞外羧基末端。主要由疏水性氨基酸组成，属于离子转运体家族，研究表明其功能主要与碘/氯离子转运有关。YangJ等学者认为，SLC26A4基因突变可引起Pendrin蛋白功能障碍，氯离子转运障碍，导致内耳淋巴液流动异常，结果使前庭水管扩大，内淋巴管内压上升，内耳毛细胞受损和听神经萎缩，最终影响听力。还有研究表明Pendrin蛋白参与协调内耳的发育，在基因水平上，它均有连接同源异形盒与转录因子的功能。SLC26A4基因目前发现的突变达120多种，遍布于各个外显子或其侧翼序列；其中错义突变占了绝大部分，此外还有剪接位点突变与框移突变。而且患者的基因型也多种多样，可以表现为一致的纯合状态，也可以是任意两种突变的组合，即表现为复合杂合状态，充分体现了突变类型的个体化，也提高了发现新的突变位点的难度。由于SLC26A4基因突变种类多样，且在不同种族间呈现出明显的多样性，不同地域、种族的优势等位基因有所不同，所以发现不同地域人种各自所特有的突变位点显得尤为重要，但目前，尚缺乏此类针对特定人种的SLC26A4基因突变位点的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T(p.P123L)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第368位所对应的碱基。优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。优选的，所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：SLC26A4-F1:5’-CCATTGTAAGTTGAGGACTTTCTG-3’；SLC26A4-R1:5’-CCAACCTAATAGAGGTATAATGCAC-3’。优选的，所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：SLC26A4-F2:5’-ACTGTAACTTTGGTTTGTGAATG-3’；SLC26A4-R2:5’-TCCCATTTCCCTGACAACAT-3’。利用上述试剂盒检测SLC26A4基因c.368C>T(p.P123L)突变的方法，包括以下步骤：1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，以上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第368位的碱基进行分型鉴定。优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与所述参考序列进行比对，确定待测个体对应于人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第368位的基因型或等位基因类型。优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型C/C、突变杂合型C/T或纯合突变型T/T。上述试剂盒在前庭导水管扩大/Pendred综合征病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测待测样本(来自于患者的SLC26A4基因片段)中对应于人SLC26A4基因(参考序列基因ID：5172)编码区第368位是否存在c.368C>T突变，从而判断该患者前庭导水管扩大/Pendred综合征发生的遗传性原因。其中，SLC26A4基因的c.368C>T突变引起位于Pendrin蛋白第二跨膜区第123位脯氨酸变成了亮氨酸(p.P123L)。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术所提出的试剂盒可用于快速地检测SLC26A4基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在SLC26A4基因c.368C>T突变，可以判断该患者的前庭导水管扩大/Pendred综合征发生原因，进而为临床诊断提供依据。本专利技术将为在前庭导水管扩大/Pendred综合征患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；同时，可以通过产前诊断筛查及新生儿SLC26A4基因突变的普遍筛查，降低前庭导水管扩大患儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。本专利技术针对420名前庭导水管扩大患者开展了SLC26A4基因的筛查，发现中国人特有的c.368C>T突变(同源氨基酸序列的进化研究结果表明，该突变位点具有高度保守性，100名听力正常人的筛查中未检测到该突变，说明这一突变与前庭导水管扩大相关)，进而提供检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒。该试剂盒将有助于快速、高效地在更大范围的前庭导水管扩大/Pendred综合征患者人群中进行突变位点的检测，为前庭导水管扩大/Pendred综合征开展临床干预提供重要的指导。附图说明图1为SLC26A4基因编码区核苷酸与氨基酸的对照：突变位于SLC26A4基因第368位(C碱基)，突变后的碱基序列使第123位(方框内)氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。图2为PCR反应过程示意图：示出了反应温度和时间，↓表示每个循环降低0.5℃。图3A为SLC26A4基因测序结果图：杂合突变序列(患者序列，CT)，箭头表示突变位点位置。图3B为SLC26A4基因测序结果图：野生型序列(CC)，箭头表示突变位点位置。图4为突变位点处氨基酸物种保守性分析：突变位点为箭头所标识位置。图5为扩增产物的电泳图谱：泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含SLC26A4基因编码区第368位所对应的碱基。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含SLC26A4基因编码区第368位所对应的碱基。2.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。3.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。4.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：SLC26A4-F1:5’-CCATTGTAAGTTGAGGACTTTCTG-3’；SLC26A4-R1:5’-CCAACCTAATAGAGGTATAATGCAC-3’。5.根据权利要求1所述一种用于检测SLC26A4基因c.368C>T突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：查定军，梁鹏飞，王淑娟，李薇，安晓刚，邱建华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61