一种制备聚肌胞的方法技术

本发明专利技术提供一种制备聚肌胞的方法，涉及生物技术领域，具体涉及一种制备聚肌胞的方法。该制备聚肌胞的方法，包括如下步骤：（1）分别合成聚肌苷酸Poly I和聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU，所述Poly CnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；（2）将聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU和聚肌苷酸Poly I退火形成错配的双链核糖核酸Poly I:CnU；（3）将双链核糖核酸Poly I:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为n bp的聚肌胞。本发明专利技术制备聚肌胞的方法，操作简单，可获得长度一致的聚肌胞。

A Method for Preparing Polymyocytes

The invention provides a method for preparing polymyocytes, which relates to the field of biotechnology, in particular to a method for preparing polymyocytes. The method for preparing Polyinosine cells includes the following steps: (1) synthesizing Polyinosine I and polycytidine uridine poly CnU respectively, inserting a uridine after each n continuous cytides in the poly CnU; (2) annealing polycytidine uridine poly CnU and Polyinosine poly I to form mismatched double stranded nucleotide poly I:CnU; (3) annealing poly I:CnU with double stranded nucleotide poly I:CnU. U was digested with S1 nuclease and polymyocytes with n bp fragment size were obtained. The method for preparing polymyocytes of the invention has simple operation and can obtain polymyocytes of the same length.

【技术实现步骤摘要】
一种制备聚肌胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种制备聚肌胞的方法。
技术介绍
聚肌苷酸胞苷酸（简称聚肌胞，PolyI:C）是一种安全高效的先天免疫激活剂，具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、增强机体免疫力等多种功能，全球市场容量潜力估值为每年数百亿美元。医学临床上，可用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎等病毒性疾病治疗，对乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的辅助性治疗已处于III期临床实验阶段。兽医临床上，可用于口蹄疫、禽流感、猪瘟等病毒性疫病的预防和治疗，亦可提高畜禽疫苗免疫效力。聚肌胞使用方便、广泛，可以与许多药物同时使用，具有协同或相加作用。无种属特异性，可广泛在家禽、猪、牛等动物上使用，同时还具有抗病毒谱广，毒性小、安全范围大的优点。上世纪六十年代，Field等成功研制出合成聚肌胞方法。其基本工艺流程是：先分别合成聚肌苷酸（PolyI）和聚胞苷酸（PolyC）单链，然后将之混合退火获得双链聚肌胞。经过几十年的发展，聚肌胞工业化生产已十分成熟。但是，现有生产方法所获得的聚肌胞分子量范围为0.05kb~8.0kb、是长度不一的混合物。50多年来，国内外学者曾尝试各种分离纯化方法，但至今尚未解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备聚肌胞的方法，该方法操作简单，可获得长度一致的聚肌胞。本专利技术的目的采用下述技术方案实现。一种制备聚肌胞的方法，包括如下步骤：（1）分别合成聚肌苷酸PolyI和聚胞苷酸尿苷酸PolyCnU，所述PolyCnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；（2）将聚胞苷酸尿苷酸PolyCnU和聚肌苷酸PolyI退火形成错配的双链核糖核酸PolyI:CnU；（3）将双链核糖核酸PolyI:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为nbp的聚肌胞。在本专利技术中，n为自然数且12≤n≤1000。在本专利技术中，酶切体系包括如下组分：15mg/ml的PolyI:CnU25μl，10×酶切缓冲液5μl，180U/μl的S1核酸酶1μl，ddH2O19μl。优选的技术方案中，所述酶切条件为55-65℃金属浴，酶切反应时间为10min。本专利技术巧妙地通过调整投料比，控制聚胞苷酸尿苷酸PolyCnU链中胞苷酸的长度。再将错配的双链核糖核酸采用S1核酸酶进行酶切，获得了片段大小一致的聚肌胞，从而控制聚肌胞的质量及药效。申请人发现，采用其他单链特异性核酸酶进行酶切，并不能获得片段大小一致的聚肌胞。本专利技术方法简单，易于操作，具有可设计性，能够获得长度一致，结构均一的聚肌胞，且免疫效果不受影响，解决了50多年来尚未解决的技术难题。附图说明图1错配的双链核糖核酸PolyI:C12U的结构示意图。图2不同单链特异性核酸酶对PolyI:C12U进行酶切所得产物的电泳图，泳道1为500bpMarker；泳道2为PolyI:C12U；泳道3为PolyI:C12U的S1核酸酶酶切产物；泳道4、5、6分别为PolyI:C12U的绿豆芽核酸酶酶切产物、PolyI:C12U的P1核酸酶酶切产物、PolyI:C12U的核糖核酸酶A酶切产物，泳道7为聚肌胞PolyI:C，泳道8为聚肌胞PolyI:C的S1核酸酶酶切产物。图3利用S1核酸酶对PolyI:C500U进行酶切所得产物的电泳图，其中泳道1为2000bpMarker，泳道2为PolyI:C500U，泳道3为PolyI:C500U的S1核酸酶酶切产物。图4各组仔猪免疫后的抗体水平。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1制备片段大小为12bp的聚肌胞本实施例说明采用S1核酸酶酶切错配的双链核糖核酸PolyI:C12U，获得片段大小为12bp的聚肌胞的步骤：（1）合成错配的双链核糖核酸PolyI:C12U。送南京金斯瑞生物科技有限公司合成错配的双链核糖核酸PolyI:C12U，片段大小为50bp～5000bp。双链核糖核酸PolyI:C12U制备方法如下：将胞嘧啶（C）与尿嘧啶（U）按照12:1的摩尔比进行投料，合成聚胞苷酸尿苷酸PolyC12U。聚胞苷酸尿苷酸PolyC12U中每12个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸。另外，合成聚肌苷酸PolyI。将聚胞苷酸尿苷酸PolyC12U与聚肌苷酸PolyI退火形成错配的双链核糖核酸PolyI:C12U，退火温度为60℃，退火时间为45s。PolyC12U与PolyI链经碱基配对形成双链时，插入的尿嘧啶导致碱基失配，形成错配的双链核糖核酸PolyI:C12U，具体结构如图1所示。（2）将PolyI：C12U采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小一致的聚肌胞。采用单链特异性核酸酶：S1核酸酶（S1Nuclease）、绿豆芽核酸酶（MungBeanNuclease）、P1核酸酶（P1Nuclease）、核糖核酸酶A（RibonucleaseA）分别酶切步骤（1）获得的双链核糖核酸PolyI:C12U，同时设立对照。上述单链特异性核酸酶均购自大连宝生物工程有限公司。酶切体系（50ul）为：浓度为15mg/ml的PolyI:C12U25μl，10×酶切缓冲液5μl，浓度为180U/μl的单链特异性核酸酶1μl，19μlddH2O。10×酶切缓冲液是含有300mmol/L的NaAc（醋酸钠）、1.0mol/L的NaCl、10mmol/L的ZnAc2（醋酸锌）和体积百分浓度为50%的甘油的水溶液。对照中以PolyI:C替代PolyI:C12U，其他成分同酶切体系。酶切条件为：在60℃金属浴中反应10min。（3）电泳检测步骤（2）酶切后的产物，观察对比酶切结果。电泳检测：取步骤（2）酶切后的产物30μl采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，结果如图2所示：泳道2为错配的双链核糖核酸PolyI:C12U，条带大小为50bp～5000bp之间；泳道3为PolyI：C12U的S1核酸酶酶切产物，大小为12bp；泳道4、5、6分别为PolyI：C12U的绿豆芽核酸酶酶切产物、PolyI：C12U的P1核酸酶酶切产物、PolyI：C12U的核糖核酸酶A酶切产物，大小均在50bp~500bp之间；泳道7为聚肌胞PolyI:C，条带大小为100bp～500bp之间；泳道7和泳道8大小基本没有变化。综上所述，S1核酸酶对于错配的双链核糖核酸PolyI:C12U的酶切效果最为理想，酶切片段为12bp。实施例2PolyI：C500的制备本实施例描述制备聚肌胞PolyI:C500的方法。PolyI：C500是指片段大小为500bp的PolyI：C。送南京金斯瑞生物科技有限公司合成错配的双链核糖核酸PolyI:C500U，片段大小为500bp-5000bp。其制备方法如下：先将胞嘧啶（C）与尿嘧啶（U）按照摩尔比为500:1进行投料，合成聚胞苷酸尿苷酸PolyC500U。聚胞苷酸尿苷酸PolyC500U中每500个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸。同时合成聚肌苷酸PolyI。将聚胞苷酸尿苷酸PolyC500U与聚肌苷酸PolyI退火形成错配的双链核糖核酸PolyI：C500U。将PolyI:C500U采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小一致的聚肌胞。酶切体系（50ul）为：15mg/ml的Pol本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备聚肌胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）分别合成聚肌苷酸Poly I和聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU，所述Poly CnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；（2）将聚胞苷酸尿苷酸Poly CnU和聚肌苷酸Poly I退火形成错配的双链核糖核酸Poly I:CnU；（3）将双链核糖核酸Poly I:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为n bp的聚肌胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备聚肌胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）分别合成聚肌苷酸PolyI和聚胞苷酸尿苷酸PolyCnU，所述PolyCnU中每n个连续的胞苷酸后插入了1个尿苷酸；（2）将聚胞苷酸尿苷酸PolyCnU和聚肌苷酸PolyI退火形成错配的双链核糖核酸PolyI:CnU；（3）将双链核糖核酸PolyI:CnU采用S1核酸酶进行酶切，得到片段大小为nbp的聚肌胞。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王义伟，郑其升，许梦微，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32