一种脂肪干细胞的培养方法技术

本发明专利技术其中一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，该方法中使用灭活的成纤维细胞进行选择性培养。本发明专利技术使用灭活的成纤维细胞能释放凋亡信号，抑制成纤维细胞的扩增，且不影响脂肪干细胞的扩增；灭活的成纤维细胞能释放各种因子如bfgf、igf‑1，TGF等，所以用该细胞当滋养层细胞培养脂肪干细胞不需要额外再添加因子，只需用基础培养基加血清替代物即可，且其扩增效率是传统方法的一倍以上。

A Method of Cultivating Adipose Stem Cells

One of the technical schemes of the invention provides a method for culturing adipose stem cells, in which inactivated fibroblasts are used for selective culture. The invention uses inactivated fibroblasts to release apoptotic signals, inhibit the proliferation of fibroblasts, and does not affect the proliferation of adipose stem cells; inactivated fibroblasts can release various factors such as bfgf, IGF 1, TGF, etc., so adipose stem cells cultured with the cells as trophoblast cells need no additional factors, only basic medium and serum substitutes can be used. And its amplification efficiency is more than twice that of traditional methods.

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪干细胞的培养方法
本专利技术属于细胞生物学领域，特别涉及脂肪干细胞。
技术介绍
脂肪干细胞来源于皮下脂肪，而皮下脂肪中包裹着丰富的结缔组织。现有的方法并不能完全分离脂肪和结缔组织，甚至还有一部分真皮层残留。结缔组织和真皮中富含成纤维细胞。成纤维细胞，也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织中主要的细胞，属于终末分化细胞。成纤维细胞体外扩增能力极强，生长速度快，环境适应力强，只要有一点残留就常会污染多种细胞培养，如表皮细胞培养、黑色素细胞培养等，这些细胞培养中一旦有了成纤维细胞污染，便难以除去从而导致实验失败。在脂肪干细胞培养过程中，由于成纤维细胞的形态结构，表型表征等与干细胞几乎一样，往往成纤维细胞污染被忽视。更糟糕的是，根据国内外现有对脂肪干细胞和成纤维细胞的鉴定标准，并无法区分这2种细胞，很多科研工作者养的脂肪干细胞已经全部都是成纤维细胞还不自知。传统的培养方法，并不能抑制成纤维细胞的生长，反而在传统的培养条件下，成纤维细胞对比脂肪干细胞有生长优势。成纤维细胞污染，会导致脂肪干细胞纯度越来越低，无论下端进行实验还是临床都不能正确评价脂肪干细胞的效果，从而导致实验误差，临床上有明显的副反应等。
技术实现思路
为了解决上述现有方法的不足，本专利技术开发了新的脂肪干细胞的培养方法，及灭活的成纤维细胞的新用途。本专利技术其中一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，该方法中使用灭活的成纤维细胞进行选择性培养。本专利技术其中另一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，灭活的成纤维细胞的制备方法为使用丝链霉素灭活。本专利技术其中另一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，上述脂肪干细胞的培养方法步骤如下：步骤a：消化脂肪；步骤b：分离出经所述步骤a消化后的混合细胞，并对剩余的疏松结缔组织进行消化得到灭活的成纤维细胞；步骤c：对所述混合细胞进行选择性培养得到脂肪干细胞，所述选择性培养的方法为在所述混合细胞中按比例添加所述灭活的成纤维细胞。本专利技术其中另一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，所述脂肪干细胞的培养方法中使用的培养基为基础培养基L-DMEM+血清替代物。血清替代物可选的其中一种为EliteGro-Advanced。本专利技术其中另一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，上述比例为5：1。本专利技术其中另一种技术方案提供了一种脂肪干细胞的培养方法，上述脂肪干细胞的培养方法步骤如下：步骤1、取自体脂肪组织；步骤2、放于无菌平皿中，用含有抗生素的生理盐水冲去表面血液；步骤3、取出经步骤2的脂肪组织，放入平皿中，用手术刀剪碎；步骤4、将经步骤3的脂肪组织转入离心管中，用DPBS洗涤，直至洗涤液澄清；步骤5、加入等脂肪组织体积消化液NB4G(德国SERVA胶原酶NB4G)；步骤6、37℃恒温震荡30到80min；步骤7、离心1500rpm/5min，此时细胞分3层：油脂、消化液及沉淀；步骤8、小心去除油脂层和消化液层；步骤9、加入PBS，大力摇晃，使细胞从结缔组织中充分脱离；步骤10、将疏松结缔组织从离心管中挑出，继续用消化液NB4G消化2个小时，步骤11、将经步骤10挑去白色疏松结缔组织的已经消化好的细胞，用事先预热好的培养基洗一遍，1500rpm/5min，按1X104/CM2的细胞量接种到培养瓶，加入10ml完全培养基，所述消化好的细胞为混合细胞；步骤12、将经步骤10挑出并消化的疏松结缔组织消化下来的细胞洗三遍；步骤13、将经步骤12洗后的细胞用20ug/ml的丝链霉素灭活3个小时，洗三遍，1500rpm/5min，按0.2X104/CM2的细胞量加到步骤11的培养瓶中。步骤14、将经步骤13的培养瓶放入37℃,5％CO2培养箱中培养，隔天换液；步骤15、当细胞融合到80％时进行传代，传代得到纯化的脂肪干细胞。本专利技术的原理如下：本发还提供了一种灭活的成纤维细胞的用途，该用途为灭活的成纤维细胞用于脂肪干细胞的培养。本专利技术其中技术方案提供了一种灭活的成纤维细胞的用途，该用途为灭活的成纤维细胞用于脂肪干细胞的选择性培养。本专利技术其中技术方案提供了一种灭活的成纤维细胞的用途，该用途中灭活的成纤维细胞来源为脂肪组织。1、灭活的成纤维细胞能释放凋亡信号，抑制成纤维细胞的扩增，且不影响脂肪干细胞的扩增；2、灭活的成纤维细胞能释放各种因子如bfgf、igf-1，TGF等，所以用该细胞当滋养层细胞培养脂肪干细胞不需要额外再添加因子，只需用基础培养基加血清活血清替代物即可，且其扩增效率是传统方法的一倍以上；3、TM4SF1在干细胞上高表达，在成纤维细胞上不表达，从而能鉴定脂肪干细胞中是否有成纤维细胞的污染，以及脂肪干细胞的纯度。本专利技术使用培养基为基础培养基L-DMEM+血清替代物本专利技术脂肪组织消化的前30min到80min消化下来的细胞主要是脂肪干细胞及成纤维细胞的混合细胞难以区分和纯化。而疏松结缔组织中消化下来的主要细胞是成纤维细胞。本专利技术使用20ug/ML的丝链霉素灭活3个小时，能使得细胞失去增值能力，但还能继续释放细胞因子，同时能释放凋亡信号抑制成纤维细胞增殖。本专利技术混合细胞：灭活的成纤维细胞比例是5:1，能抑制混合细胞中成纤维细胞的扩增，同时能提高脂肪干细胞的扩增效率。本专利技术验证效果的流式抗体：CD14,CD34,CD44,CD45,CD73,CD79a，CD90,CD105,HLA-DR，TM4SF1。前9个是根据2013年国际细胞治疗协会(TheInternationalSocietyofCellularTherapy,ISCT)的声明，国内外公认的干细胞鉴定的标准抗体，但本专利技术发现，这些抗体在成纤维细胞上的表达情况跟干细胞一样，TM4SF1是本专利技术人筛选出在干细胞是表达，脂肪干细胞上不表达的蛋白。本专利技术人的另一专利技术“一种皮肤来源的成纤维细胞培养方法”(专利号ZL201710734675.2)，用该方法在皮肤的真皮层取得了纯化的成纤维细胞，通过流式鉴定CD14,CD34,CD44,CD45,CD73,CD79a，CD90,CD105,HLA-DR跟脂肪干细胞一模一样。脐带干细胞来源于脐带华通氏胶，其中没有真皮层也没有结缔组织，故而其提取的干细胞是不存在成纤维细胞污染问题的。成纤维细胞的鉴定方法国内外公认的是FSP-1以及Vimentin，我们发现在脐带干细胞中这个2个标志物都是表达的。也就是说现有的方法完全无法区分成纤维细胞和间充质干细胞。4次跨膜L6家族成员1(Transmembrane-4L-sixfamilymember-1，TM4SF1)最早于1986年作为肿瘤细胞抗原而被发现。TM4SF1是一种小分子的质膜糖蛋白，主要参与细胞迁移、粘附与增殖的调控，在体内的诸多生物学行为进程中发挥重要作用。目前，关于TM4SF1的研究主要集中在抗肿瘤领域，有不少学者将TM4SF1作为肿瘤干细胞的标志物进行研究。在以上背景的启发下，我们尝试通过TM4SF1去鉴别成纤维细胞与脐带干细胞。我们通过RT-PCR与FACS验证了成纤维细胞不表达TM4SF1，而脐带干细胞高表达。我们首次发现了TM4SF1在成纤维细胞与脐带干细胞上的区别。接着我们用传统的脂肪干细胞培养方法进行培养，并用传统流式抗体和TM4SF1进行鉴定，发现原代的脂肪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的培养方法中使用灭活的成纤维细胞进行选择性培养。

【技术特征摘要】
1.脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的培养方法中使用灭活的成纤维细胞进行选择性培养。2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，所述灭活的成纤维细胞的制备方法为使用丝链霉素灭活。3.根据权利要求2所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的培养方法步骤如下：步骤a：消化脂肪；步骤b：分离出经所述步骤a消化后的混合细胞，并对剩余的疏松结缔组织进行消化得到灭活的成纤维细胞；步骤c：对所述混合细胞进行选择性培养得到脂肪干细胞，所述选择性培养的方法为在所述混合细胞中按比例添加所述灭活的成纤维细胞。4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的培养方法中使用的培养基为基础培养基L-DMEM+血清替代物。5.根据权利要求3所述的脂肪干细胞的培养方法，其特征在于，所述比例为5：1。6.根据权利要求2所述的脂肪干细胞的培养方法，所述脂肪干细胞的培养方法步骤如下：步骤1、取自体脂肪组织；步骤2、放于无菌平皿中，用含有抗生素的生理盐水冲去表面血液；步骤3、取出经步骤2的脂肪组织，放入平皿中，用手术刀剪碎；步骤4、将经步骤3的脂肪组织转入离心管中，用DPBS洗涤，直至洗涤液澄清；步骤5、加入等脂肪组织体积消化液NB4G；步骤6、37℃恒温震荡30到80min...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴勋，杨娟，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科医联创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31