乙肝肝炎病毒功能性受体的组成以及相关应用制造技术

本发明专利技术主要涉及了通过调节NTCP的蛋白、多核苷酸的表达和/或功能以及其与病毒的相互作用来治疗或预防哺乳动物的乙肝病毒和/或丁肝病毒感染，以及感染引起的相关疾病的组成和方法。这一发明专利技术也提出了通过外源表达SLC10A1基因而获得HBV和/或HDV易感性的细胞系和非人转基因动物模型用于筛选针对病毒感染和相关疾病的候选药物。

Composition and Application of Functional Receptor of Hepatitis B Virus

The invention mainly relates to the treatment or prevention of hepatitis B virus and/or hepatitis D virus infection in mammals by regulating the expression and/or function of NTCP and its interaction with viruses, as well as the composition and method of related diseases caused by infection. The invention also proposes cell lines and non-human transgenic animal models susceptible to HBV and/or HDV by exogenous expression of SLC10A1 gene for screening candidate drugs for viral infection and related diseases.

【技术实现步骤摘要】
乙肝肝炎病毒功能性受体的组成以及相关应用本申请是2012年4月25日提交的中国专利申请号：201280072562.6的分案申请。
本专利技术主要涉及了通过调节NTCP的蛋白、多核苷酸的表达和/或功能以及其与病毒的相互作用来治疗或预防哺乳动物的乙肝病毒(HBV)和/或丁肝病毒(HDV)感染，以及感染引起的相关疾病的组成和方法。
技术介绍
全球约有两亿人感染过乙肝病毒(HBV)，目前约有三亿五千万人患有慢性乙型肝炎，这些人有较高机率进展为肝硬化、肝衰竭以及肝癌。全球超过半数的原发性肝癌与HBV感染有关。这些患者若同时被HBV的卫星病毒乙肝病毒(HDV)感染，会导致更快的病程进展并有更严重的临床症状(Lavanchyetal.,JViralHepat11,97(2004)；Hughesetal.,Lancet378,73(2011))。长期以来，病毒入侵的机制仍然不清晰、受体的分子本质也不清楚。HBV是一种包膜病毒，其基因组由一3.2kb的不完全双链环状DNA构成，含有四个相互重叠的读码框。HBV的外膜蛋白由小(S)、中(M)、大(L)三种多次跨膜的外膜蛋白组成，它们都含有S结构域，因而拥有共同的C端序列但N端起始的位置不同。(图1A)(Seegeretal.,inField'sVirology,D.M.Knipe,P.M.Howley,Eds.(Lippincott,Williams,andWilkins,Philadelphia,2007),vol.2,pp.2977；Heermannetal.,JVirol52,396(1984)).HDV是HBV的卫星病毒，其基因组为一单链RNA。HDV利用HBV的三种外膜蛋白进行包装，因此其生活史依赖于HBV的增殖。HDV是研究HBV入侵过程的常用工具，因为其早期入侵过程，特别是受体结合过程被认为与HBV是极其相似的(Hughesetal.,Lancet378,73(2011)；Sureau,CurrTopMicrobiolImmunol307,113(2006)；Barreraetal.,JVirol78,5233(2004))。L蛋白与S蛋白的完整性对于HBV、HDV的感染非常重要。其中L蛋白的preS1结构域一直被认为是与肝细胞表面特异性受体的关键区域(Seyecetal,.JVirol73,2052(1999)；Blanchet&Sureau,JVirol81,5841(2007)；Duffetal.,JVirol83,12443(2009)；Chouteauetal.,JVirol75,11565(2001))。过去曾有许多蛋白被报道可以与preS1结合，然而这些蛋白没有一个在后续的实验中被认为是与病毒的感染过程中是必须的(Glebe&Urban,WorldJGastroenterol13,22(2007))。因此,目前仍然有必要开发有效的方法用于治疗和预防HBV和/或HDV感染以及相关疾病，同时我们也需要开发体外细胞感染系统和转基因动物模型用于筛选可以治疗与预防HBV和/或HDV的药物。
技术实现思路
我们发现肝脏特异性表达的多次跨膜蛋白钠离子/牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)可以与HBV和HDV通过L蛋白相互作用，是这两种病毒共同的功能性受体。基于这一发现，本专利技术涉及通过调节NTCP蛋白、多核苷酸的表达和/或功能以及其与病毒的相互作用来治疗或预防哺乳动物的乙肝病毒和/或丁肝病毒感染，以及感染引起的相关疾病的组合物和方法。从一方面来说，该专利技术提供了用于治疗或预防哺乳动物乙肝病毒/或丁肝病毒感染，以及所述感染的相关疾病的方法。所述方法包括对需要预防与治疗的哺乳动物使用有效量的药物来防止或降低NTCP的表达和/或功能，或防止或降低HBV和/或HDV与NTCP之间的相互作用。上述的哺乳动物可以是人类、黑猩猩、树鼩或其它动物，如表达人类、黑猩猩、树鼩NTCP的小鼠或大鼠。在一些实施方案中，这些动物还包括移植了人类、黑猩猩、树鼩原代肝细胞的动物。在一些实施方案中，这些方法可以用于治疗乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒的感染。在一些实施方案中，这些方法可以用于预防乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒的感染。在一些实施方案中，这些方法可以同时用于预防与治疗乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒的感染。这些分子不包括基于HBV的L蛋白的N端2-48残基的多肽或针对这一多肽的抗体。这些试剂可以是阻止或减少NTCP的表达和/或功能的试剂。在一些实施方案中，可以是靶向编码NTCP的基因的siRNA，包括针对树鼩SLC10A1的基于siRNA-1和siRNA4序列的siRNA,以及针对人SLC10A1的基于siRNA-11,siRNA-405,siRNA-406,siRNA-pool(4)，siRNA-pool(5),siRNA-pool(6),siRNA-pool(7)的序列的siRNA，以及靶向编码NTCP的基因的反义RNA。在一些实施方案中，这些试剂可以是一些抑制或修饰控制NTCP转录的核转录因子的分子。例如pan-RAR的激动剂TTNPB，全反式维甲酸(ATRA)，9-顺式维甲酸(9CRA)，等等。在一些实施方案中，这些分子可以是一些抑制或修饰组蛋白或基因组DNA修饰而调控NTCP表达的分子。如DNA甲基化抑制剂，包括胞嘧啶核苷酸类似物如5-azacytidine，5-aza-2’-deoxycytidine(5-azadC)；MG98(一种反义的寡聚DNA针对DNA甲基化酶-1的mRNA的3’未翻译区)；组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂，HDI)如vorinostat(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA)和mocetinostat(MGCD0103)都在专利技术可能的应用之中。在一些实施方案中，这些分子也可是以能够抑制NTCP磷酸化和/或糖基化的分子，如Tunicamysin可以抑制所有的蛋白的N-糖基化过程，以及PI3K抑制剂如LY294002和wortmannin等。这一试剂可以是能够阻止或降低相关哺乳动物中HBV/HDV与NTCP的相互作用的分子。例如，某种特异性针对NTCP的抗体，通过特异性结合NTCP上负责结合乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒的某个区域发挥作用，例如一些胞外的结构域。在一些实施方案中，这结胞外结构域可以是NTCP的17-27,73-89,142-152,207-217或275-278残基。在一些实施方案中，这些分子可以是NTCP的变体形式，如NTCP的突变体、NTCP的片断、NTCP的可溶性多肽。在一些实施方案中，这些片断来源于NTCP的膜外区域。在一些实施方案中，NTCP的突变体不支持乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒的感染但仍然有转运能力，如小鼠、大鼠的NTCP。在一些实施方案中，这些分子可以是NTCP的底物或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，这些底物含有胆酸类分子的骨架，如牛磺石胆酸、石胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨酸胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸。该方法包括进一步与此试剂一起施用药学上可接受的载体以及赋形剂。在一些实施方案中，这些试剂可以通过口服、经鼻、吸入、母婴传播、静脉注射、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体，其具有选自如下的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：1所显示的人NTCP蛋白的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：2所显示的树鼩NTCP蛋白的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO：3所显示的黑猩猩NTCP蛋白的氨基酸序列；和(d)与上述(a)‑(c)任一项的氨基酸序列有至少90％同一性，并且具有作为乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体的活性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体，其具有选自如下的氨基酸序列：(a)SEQIDNO：1所显示的人NTCP蛋白的氨基酸序列；(b)SEQIDNO：2所显示的树鼩NTCP蛋白的氨基酸序列；(c)SEQIDNO：3所显示的黑猩猩NTCP蛋白的氨基酸序列；和(d)与上述(a)-(c)任一项的氨基酸序列有至少90％同一性，并且具有作为乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体的活性的氨基酸序列。2.分离的核苷酸，其编码权利要求1所述的乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体。3.一种易受HBV或HDV感染的细胞，所述细胞中外源转入了权利要求2所述的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的易受HBV或HDV感染的细胞，所述易受HBV或HDV感染的细胞在转入权利要求2所述的核苷酸序列前是不易受HBV或HDV感染的细胞。5.根据权利要求4所述的易受HBV或HDV感染的细胞，所述不易受HBV或HDV感染的细胞选自失去HBV或HDV感染敏感性的原代人肝细胞或原代树鼩肝细胞或黑猩猩原代肝细胞，人或树鼩肝癌细胞，小鼠或大鼠肝细胞。6.根据权利要求4所述的易受HBV或HDV感染的细胞，所述不易受HBV或HDV感染的细胞为肝癌细胞Huh-7或HepG2。7.根据权利要求3所述的易受HBV或HDV感染的细胞，所述易受HBV或HDV感染的细胞是外源转入权利要求2的分离的核苷酸序列的小鼠或大鼠的肝细胞。8.稳定表达权利要求1所述的乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体的Huh-7或HepG2细胞系。9.人NTCP蛋白的突变体，所述突变体具有SN105/106AA和/或E257A突变，或者所述突变体具有Q68A和/或S226A突变。10.权利要求1限定的乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)的功能性受体的胞外结构域。11.权利要求11的胞外结构域，所述胞外结构域选自NTCP的17-27，73-89，142-152，207-217或275-278残基。12.载体，所述载体编码树鼩NTCP蛋白或其变体，或者编码人NTCP蛋白或其变体，或者编码黑猩猩NTCP蛋白或其变体。13.权利要求12的载体在构建NTCP基因敲除或基因敲入非人转基因动物模型中的应用。14.权利要求12的载体在构建乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染的非人转基因动物模型中的应用。15.载体系统，所述载体系统包含一个能够与人类、黑猩猩或树鼩的SLC10A1基因序列同源重组的载体以及一个能够进行人类NTCP蛋白、黑猩猩NTCP蛋白或树鼩NTCP蛋白的外源表达的载体。16.权利要求15的载体系统在构建NTCP基因敲除或基因敲入非人转基因动物模型中的应用。17.权利要求15的载体系统在构建乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染的非人转基因动物模型中的应用。18.建立乙型肝炎病毒感染和/或丁型肝炎病毒感染的非人转基因动物模型的方法，所述方法包括通过转基因技术将受体非人动物的原SLC10A1基因替换为表达外源人类SLC10A1基因、黑猩猩SLC10A1基因或树鼩SLC10A1基因的基因敲入小鼠；或者所述方法包括首先基因敲除受体非人动物的SLC10A1基因，然后进一步改造成表达来自人类的SLC10A1基因、或来自树鼩的SLC10A1基因。19.权利要求13，14，16和17任一项所述的应用，权利要求18所述的方法，其中所述的非人动物是小鼠、大鼠、非人灵长类动物、非人哺乳动物。20.用于稳定表达hNTCP的HepG2细胞系，所述细胞系中转染了人NTCP的表达载体。21.用于获得稳定表达hNTCP的HepG2细胞系的方法，所述方法包括如下步骤：(1)用人NTCP基因表达载体转染HepG2细胞；以及(2)将转染人NTCP基因表达载体的HepG2细胞在含有DMSO的原代肝细胞维持培养基中培养。22.根据权利要求21的方法，所述含有DMSO的原代肝细胞维持培养基由如下成分构成：5μg/ml的转铁蛋白，10ng/ml的EGF，3μg/ml的胰岛素，2mM的L-谷氨酰胺，18μg/ml的氢化可的松，40ng/ml的地塞米松，5ng/ml的亚硒酸钠，2％的DMSO，含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文辉，严欢，钟国才，徐广伟，何文辉，隋建华，景志毅，黄屹，
申请(专利权)人：华辉安健北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11