一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用技术

本发明专利技术属于生物材料制备领域，涉及一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用。通过处理酵母细胞，制备高分散性功能微球，将金纳米颗粒快速自组装在处理后的酵母表面，用于免疫分析。本发明专利技术的要点在于，收集适当培养的酵母细胞，洗涤离心和甲醛处理后，用Decoating处理液处理，得到处理后的酵母微球，用处理后的酵母微球负载金纳米颗粒。本发明专利技术制备的功能微球机械刚性结构更加稳定，可快速负载金纳米颗粒且不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠，利用处理后的酵母微球负载胶体金后制备的等离子体金微球，可以显著提高在免疫分析中的灵敏度。本发明专利技术还公开了制备的酵母微球在动物免疫生物检材中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用
本专利技术属于生物材料制备
，具体涉及一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用。
技术介绍
基于微球载体的流式分析技术(如液相悬浮式生物芯片)是一种以微球为反应载体的新型分析技术，可以实现对一种到数百种甚至更多不同的生物分子如蛋白质、多肽、核酸和药物等目标分析物进行高灵敏度定量检测。与传统的平面分析技术如固态平面阵列式芯片、酶联免疫(ELISA)分析技术等相比较，流式分析技术具有重复性好、反应速度快、灵活性好、灵敏度高、可用于非常小体积中单个目标和多目标分子同时分析测定、特异性高、线性范围宽、以及操作简便等优点，在生物、医学、环境等基础和应用研究领域具有巨大的应用前景，因而越来越受到人们的广泛关注。可悬浮于水体中微球是流式分析技术的核心元件，因为目标分子的捕获和检测都是在微球表面实现的。因此，微球的价格、性能是流式分析技术推广应用的关键之一。目前，用于流式分析测定的微球主要通过化学合成的方式制备，如聚合物微球1、磁性微球2、二氧化硅微球3和光子晶体4等。由于流式分析方法检测的是微球表面的荧光分子，提高微球表面的荧光信号、减少微球表面的非特异性吸附并降低检测噪声是提高流式分析灵敏度的有效途径。近年来，将金纳米颗粒组装到微球表面形成等离子体金微球(plasmonicgoldmicrosphere,pGM)被证明是提高流式分析检测灵敏度的有效途径之一。这是因为金纳米颗粒表面的等离子体效应可以有效增强其表面荧光探针的荧光量子产率5-8,进而来有效提高流式检测方法的灵敏度。pGM的另一个优势是捕获探针可以通过金-硫键的方式直接吸附到微球表面以用于流式分析测定6,7，相对于传统的化学偶联方法如戊二醛8,9法、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)法和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)10-12法，这种偶联方式更加环境友好、快速、便于操作。但是，目前使用的化学合成法制备功能微球过程中会不可避免地使用到一些对人体和环境有害的有机试剂。此外，采用传统的搅拌和挤出等技术较难制备出尺寸、外形、表面和光学性质均一的功能微球13,14。因此，发展一种环境友好、操作简单、低成本的方法用以大量制备性能优良、高度均一的pGM具有重要的应用价值和研究意义。近年来，申请人提出采用单细胞微生物制备功能微球的设想：因为大多数单细胞微生物细胞形状具有高度均一性，且在水溶液等介质中具有较好的悬浮性。这一优点是采用化学方法合成的微球无可比拟的。为此，申请人采用芽胞杆菌的休眠体—芽胞为材料成功地证明了这一设想：芽胞可以用于制备成高度分散性、均一性好的功能微球；这种基于芽胞的微球表面带有官能团(无需化学修饰)，因此可以通过化学吸附的方式在其表面吸附纳米颗粒(如金纳米颗粒)、金属离子制备成具有不同功能的复合功能微球，在流式分析检测生物分子领域具有巨大的应用潜力15-19。与传统的化学方法合成功能微球相比，采用单细胞微生物制备功能微球用于流式分析具有如下优点：1)可以通过生物发酵的方式大量生产基于芽胞的功能微球，因此，能满足价格低廉、环境友好的迫切需要；2)基于芽胞的功能微球具有形态均一、性能稳定、自带官能团、良好刚性和光学性能等优点，特别适用于流式分析测定。但是，采用芽胞制备功能微球的方法尚有如下问题需要解决：1)芽胞的形成周期较长(通常需要1周的时间)，不利于高通量、快速生产功能微球；2)不同的芽胞杆菌的芽胞在形状、大小上是有差异的，理论上可以采用不同的芽胞形状差异进行编码；但是，大多数芽胞个体大小在1μm左右，常规流式细胞仪的分辨力不足，难以实现解码。针对采用芽胞制备功能微球并用于流式分析测定生物靶标分子过程中所遇到的困难和问题，本研究期望能够采用酵母细胞代替细菌芽胞制备新型功能微球。这一设想主要依据如下：1)通常只需要1天时间就可收集并获得酵母细胞，这一生长速度比芽胞的形成速率快得多，因此更加便宜、易得；2)已有关于活酵母细胞用于生物传感分析的研究和报道20,21，也有少数的工作是在酵母细胞表面展示单链抗体(scFvs)(或抗原)用于流式分析检测相应的抗原(或抗体)22,23。采用酵母细胞用于流式分析相关报导较少的主要原因包括：1)酵母表面展示相关单链抗体或抗原蛋白需要高度专业训练，且操作过程复杂；2)不同生物分子的表面展示效率存在差异，也并非所有捕获分子(即抗体或抗原)都能有效地、规则地展示在酵母细胞表面上。为了发挥生物法制备功能微球以及胶体金纳米颗粒表面效应的优势，克服细菌芽胞制备微球时间长以及酵母表面展示困难等缺点。本研究使用灭活的酵母细胞制备基于酵母的pGM并用于流式-荧光免疫分析测定，本专利技术的技术方案如下所述：1)首先使用10％甲醛使酵母细胞失活，然后使用decoating缓冲液处理失活的酵母细胞以制备基于酵母的微球(yeast-basedmicrospheres,YMs)。2)金纳米颗粒(胶体金)快速自组装到YMs表面，通过化学吸附形成酵母@胶体金微球。研究decoating缓冲液处理后的酵母微球可以大大提高胶体金组装到其表面的吸附速率和效率的机理。3)申请人以所构建的酵母@胶体金微球为检测平台，选择检测分析伪狂犬病病毒(PRV)感染事件作为研究对象，证实酵母@胶体金微球可以用于流式分析检测目标生物分子；申请人首先将PRV的糖蛋白E(gE)作为捕获蛋白包被在酵母@胶体金微球的表面上，带有探针的微球悬浮在样品溶液中以捕获血清样品中的目标分子(gE蛋白的抗体)并诱导初级免疫识别，然后再加入Alexa647标记的山羊抗猪IgG并混合均匀以启动第二次免疫识别，最后利用流式细胞仪检测标记有荧光报告分子Alexa647的免疫微球的荧光强度，其荧光强度则与样品中抗体的浓度在一定范围内呈线性关系。因此，利用本实验所构建的方法可以实现对血清样品中的抗体组分的定性和定量分析。研究结果表明：酵母@胶体金微球在生物分子检测的应用研究和临床疾病诊断中具有良好的应用前景。基于酵母的特性，本专利技术探索出一种基于生物发酵的方法制备功能性单分散微球的新方法，然后将胶体金纳米颗粒自组装到酵母微球表面，并成功用于免疫分析测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种新的简单快速制备高度单分散的功能微球的方法。然后将胶体金纳米颗粒自组装在处理后的酵母表面，将其应用于免疫分析测定。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：首先将培养到对数生长期的(培养约12h后，OD600值为1-2)的酵母细胞通过离心(2min，6000gmin–1)收集起来，然后用去离子水洗涤菌体三次以除去多余的培养基，最后用10％的甲醛溶液重悬，4℃放置6h；再进行超声处理，然后用去除缓冲液(Decoatingbuffer)24-29处理，最后得到酵母微球，然后用该微球负载金纳米颗粒用于免疫测定分析。具体地，本专利技术的技术方案如下所述：一种酵母功能微球的制备方法，包括下列步骤：(1)配制YPD液体培养基(见实施例3)，将所述的培养基在121℃灭菌20min，用YPD液体培养基活化酵母菌6-8h，连续活化两次，使酵母菌菌种活性处于较高的状态，当OD600值为0.3-0.9时，按照1％(v/v)的接种比例扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用酵母菌制备功能微球的方法，其特征包括下列步骤：(1)配制YPD液体培养基，灭菌后用该培养基活化酵母菌6‑8h，连续活化两次，当OD600值为0.3‑0.9时，按1％体积的量接种后进行扩大培养，然后在28℃，200rpm的恒温摇床中培养，培养至10h时，取样并在显微镜下观察，此后，每隔半小时取样观察一次，培养12h后在显微镜下观察到的酵母细胞形态大小一致时，立即离心收集酵母细胞，并用去离子水洗涤并离心，重复3‑5次；(2)用10％浓度的甲醛溶液将酵母细胞重悬，4℃放置6h，离心去除甲醛溶液，用去离子水洗涤或离心，重复3次；然后用30mL去离子水重悬湿重为1g的酵母菌菌体，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220W～450W，振幅为0％‑80％，超声处理5‑30min，超声处理为间歇操作，即在冰浴中超声3s停3s；(3)将上步处理的酵母用去离子水离心和洗涤，重复3次；(4)按每1g湿重的酵母菌菌体配制30mL去除缓冲液(Decoating Buffer)的要求配置去除缓冲液并将酵母重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5‑2h，将处理后的酵母用去离子水离心和洗涤，重复6‑10次，最后用适量的去离子水重悬，得到酵母微球；(5)将制备好的胶体金纳米颗粒与制备好的浓度范围为106‑108个/mL的酵母悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育5‑60min，使胶体金颗粒均匀吸附在酵母表面，形成酵母@胶体金的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的胶体金纳米颗粒。...

【技术特征摘要】
1.一种利用酵母菌制备功能微球的方法，其特征包括下列步骤：(1)配制YPD液体培养基，灭菌后用该培养基活化酵母菌6-8h，连续活化两次，当OD600值为0.3-0.9时，按1％体积的量接种后进行扩大培养，然后在28℃，200rpm的恒温摇床中培养，培养至10h时，取样并在显微镜下观察，此后，每隔半小时取样观察一次，培养12h后在显微镜下观察到的酵母细胞形态大小一致时，立即离心收集酵母细胞，并用去离子水洗涤并离心，重复3-5次；(2)用10％浓度的甲醛溶液将酵母细胞重悬，4℃放置6h，离心去除甲醛溶液，用去离子水洗涤或离心，重复3次；然后用30mL去离子水重悬湿重为1g的酵母菌菌体，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220W～450W，振幅为0％-80％，超声处理5-30min，超声处理为间歇操作，即在冰浴中超声3s停3s；(3)将上步处理的酵母用去离子水离心和洗涤，重复3次；(4)按每1g湿重的酵母菌菌体配制30mL去除缓冲液(DecoatingBuffer)的要求配置去除缓冲液并将酵母重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5-2h，将处理后的酵母用去离子水离心和洗涤，重复6-10次，最后用适量的去离子水重悬，得到酵母微球；(5)将制备好的胶体金纳米颗粒与制备好的浓度范围为106-108个/mL的酵母悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育5-60min，使胶体金颗粒均匀吸附在酵母表面，形成酵母@胶体金的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的胶体金纳米颗粒。2.如权利要求1所述的一种利用酵母菌制备功能微球的方法，其特征在于：所述的酵母菌为毕赤酵母(Pichiapastoris)。3.如权利要求1所述的一种利用酵母菌制备功能微球的方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒选自胶体金。4.如权利要求1或3所述的一种利用酵母菌制备功能微球的方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒的粒径为8-20nm。5.一种酵母菌功能微球的应用，其特征包括下列步骤：(1)配制YP...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡涌刚，项玉强，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42