一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法技术

本发明专利技术公开一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法，该方法采用Vero细胞培养的猪流行性腹泻病毒，依次通过离心、超滤浓缩、Capto Core 700粗提和PEG8000精提等相结合的方法，有效去除细胞碎片和杂蛋白(杂蛋白去除率95％以上)，病毒回收率高(回收率达91.2％)，且不影响纯化后的猪流行性腹泻病毒活性，通过此组合方法纯化的病毒能最大程度的保留传染性病毒颗粒的完整结构。纯化后的病毒抗原可直接用于ELISA包被抗原、制备单抗和制备猪流行性腹泻病毒疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法
本专利技术属于生物疫苗领域，具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性的猪肠道传染病，以腹泻、呕吐和脱水为主要特征。各年龄阶段猪均易感，发病率100％，死亡率80％～100％。给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV为冠状病毒科(Coronviridae)冠状病毒属(Coronavirus)成员。其基因组是单股正链RNA病毒，全长27000～33000个核苷酸(nt)，分子量为6×106～8×106。PEDV和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)同属于I群冠状病毒家族，具有典型的冠状病毒形态：多样性，倾向圆形，外有囊膜包裹，囊膜上有呈放射性排列的花瓣状纤突，病毒粒直径约为130nm，本病毒对乙醚、氯仿及其他脂溶剂敏感，在4℃PH5.0～9.0和37℃PH6.5～7.5稳定，抵抗力不强，一般的消毒液均可将其杀死。PEDV的主要结构蛋白有S(Spikeprotein)蛋白、M(membraneprotein)蛋白、E(envelopeprotein)蛋白和N(nucleocapsidprotein)蛋白。S蛋白由1383个氨基酸组成，分子量为180～220ku，构成病毒粒子表面呈皇冠状的纤突，也俗称“冠”。S蛋白在受体细胞结合吸附、膜融合等方面发挥着重要作用，是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫蛋白，S变异会改变PEDV毒株的免疫原性，从而导致现有疫苗的失败。故PEDV的纯化的好坏关在在于“冠”的保存程度纯化后“冠”越完整，其免疫活性就越好。该病1971年首次在英国被发现，随后，其它欧洲国家和部分亚洲国家相继报道了该病的发生与流行。我国是上世纪80年代初首次发生PEDV；2010年冬季以来，流行性腹泻在我国10多个省市暴发并呈现新的流行特征：发病率和致死率高、流行广、损失大，而且以前接种过猪流行性腹泻疫苗的猪也未能幸免，提示该流行毒株毒力较强，而且可能与现有疫苗毒株存在较大的差异，导致现有疫苗难以提供免疫保护。预防PED的主要方式是疫苗免疫，由于该病没有特效治疗药物，早期血清学检测是预防和控制该病的关键。酶联免疫吸附法(ELISA)是一种常用的检测血清抗体的方法，经济实用，特别适合大规模检测。然而，用细胞培养病毒作为抗原存在一定的非特异，这是因为用Vero细胞培养的PEDV免疫猪获得的猪血清可与ELISA中细胞组分蛋白抗原反应，从而诱导高背景和特异性低。故去除高背景和提高反应特异性，迫切需要获得高质量的病毒抗原。目前病毒浓缩和纯化的方法主要有：蔗糖密度梯度超速离心法，尺寸排阻色谱法和硫酸铵沉淀。然而，PEDV颗粒脆弱，无法承受超速离心或高浓度盐的高渗作用，故有必要开发新的工艺提纯PEDV。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种回收率高，无外源蛋白，纯度和回收率高且不影响猪流行性腹泻病毒活性的细胞培养猪流行性腹泻病毒的纯化方法。为解决上述问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法，包括以下步骤：(1)采用复合模式介质CaptoCore700，通过层析柱对所述猪流行性腹泻病毒的病毒培养液进行粗提得到病毒粗提液；(2)在所述病毒粗提液中加入终浓度体积比为5％-15％的PEG8000进行浓缩处理。所述病毒培养液通过如下病毒培养方法获得：用Vero细胞，DMEM基本培养基对猪流行性腹泻病毒CV777疫苗株进行培养，当细胞出现70％以上的病变时，收集病毒液，-20℃冻融一次，得到病毒培养物。所述病毒培养方法还包括：将所述病毒培养物4℃低速3000rpm离心30min，收集上清，经0.45um滤器过滤得到所述病毒培养液。离心目的是去掉细胞碎片，过滤目的是去掉病毒上清中的分子量大于该病毒的杂质。步骤(1)中的所述粗提指：将所述复合模式介质CaptoCore700搅拌均匀加入所述层析柱内，用双蒸水以1ml/min的流速冲洗3个柱体积；再用病毒纯化缓冲液以0.8ml/min的流速对柱子平衡2个柱体积，将所述适量病毒培养液加到层析柱中，收集得到的流穿液即所述病毒粗提液。上述各流速均为优化后的流速，目的在于使最终的纯化效果达到最优。所述层析柱为XK16/20，GEhealthcare层析柱。步骤(2)中的所述浓缩处理指：在流穿液中加入终浓度为体积比10％的PEG8000，4℃冰箱冷藏过夜，使病毒充分沉淀浓缩；将PEG沉淀处理的样品在10000g离心30分钟，弃上清，加入适量病毒纯化缓冲液重悬；将沉淀后的病毒加入缓冲液重悬有利于后续的病毒保存。离心的目的在于将经PEG析出的病毒分子进一步通过离心处理进行沉淀、分离。PEG8000为水溶性非离子型聚合物，用于病毒沉淀的分子量主要为2000～6000的PEG。我们在这里选用PEG8000，主要在于：PEG的沉淀效果主要与本身的分子量有关，同时还受离子强度、溶液、PH值和温度等因素的影响。在一定条件下，PEG浓度越高，浓缩效果越好，但是PEG浓度高会使较小的非病毒蛋白也会浓缩沉淀，故应该选择合适的PEG浓度。在一定PH值下，盐浓度越高，所需PEG的浓度越低，溶液的PH值越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG沉淀的效率高。PEG8000为液体中不同分子的分布和分离提供良好的媒介环境，在这种环境中有利于病毒这类大分子从溶液中沉淀析出，而液体中的其它分子量较小的物质则仍以溶解态存在于液体中。采用体积比5％-15％的PEG8000能使这种沉淀析出效果一个优异的效果程度。故，在保持病毒本身最优特性的条件下，针对猪流行性腹泻病毒本身的特点，经过多次试验，筛选出一个最优PEG浓缩病毒的浓度范围为体积比5％-15％的PEG8000。一种用于纯化猪流行性腹泻病毒的试剂盒，包括挂载有复合模式介质CaptoCore700的层析柱和PEG8000；所述载有复合模式介质CaptoCore700的层析柱用于粗提所述纯化猪流行性腹泻病毒的病毒培养液；所述PEG8000用于对所述粗提所得产物进行浓缩处理。所述浓缩处理指在所述粗提所得产物中加入一定比例的PEG8000。所述试剂盒还包括病毒培养领域和/或，病毒纯化领域的常规试剂；例如，Vero细胞、EMEM基本培养基、病毒纯化缓冲液、双蒸水等。所述的纯化方法，和/或所述的试剂盒在病毒纯化领域的应用。在本专利技术最具体的实施例中，所述纯化方法包括如下步骤：1)病毒培养：用Vero细胞，EMEM基本培养基对猪流行性腹泻病毒CV777疫苗株进行培养，当细胞出现70％以上的病变时，收集病毒液，-20℃冻融一次。2)细胞培养的猪流行性腹泻病毒培养物4℃低速3000rpm离心30min，收集上清，经0.45um滤器过滤，4℃保存备用。3)抗原粗提(1)层析柱固定，将CaptoCore700介质搅拌均匀加入柱内(XK16/20，GEhealthcare)，用双蒸水以1ml/min的流速冲洗3个柱体积。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法，包括以下步骤：(1)采用复合模式介质Capto Core 700，通过层析柱对所述猪流行性腹泻病毒的病毒培养液进行粗提得到病毒粗提液；(2)在所述病毒粗提液中加入终浓度体积比为5％‑15％的PEG8000进行浓缩处理。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法，包括以下步骤：(1)采用复合模式介质CaptoCore700，通过层析柱对所述猪流行性腹泻病毒的病毒培养液进行粗提得到病毒粗提液；(2)在所述病毒粗提液中加入终浓度体积比为5％-15％的PEG8000进行浓缩处理。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述病毒培养液通过如下病毒培养方法获得：用Vero细胞，DMEM基本培养基对猪流行性腹泻病毒CV777疫苗株进行培养，当细胞出现70％以上的病变时，收集病毒液，-20℃冻融一次，得到病毒培养物。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述病毒培养方法还包括：将所述病毒培养物4℃低速3000rpm离心30min，收集上清，经0.45um滤器过滤得到所述病毒培养液。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中的所述粗提指：将所述复合模式介质CaptoCore700搅拌均匀加入所述层析柱内，用双蒸水以1ml/min的流速冲洗3个柱体积；再用病毒纯化缓冲液以0.8ml/min的流速对柱子平衡2个柱体积，将所述适量病毒培养液加到层析柱中，收集得到的流穿液即所述病毒粗提液。5.根据权利要求1或4所述的纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，刘伯华，刘巧荣，邓小雨，申屠芬琴，张丽，田克恭，吴培星，陈西钊，
申请(专利权)人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，中国动物疫病预防控制中心农业部屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：北京,11