一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗，涉及动物生物制品领域。本发明专利技术提供的重组猪伪狂犬病毒的保藏编号为CGMCC No：16289。该重组猪伪狂犬病毒是经人工改造后得到的，其致病性被去除，缺失了伪狂犬病毒TK、gI、gE、11K和28K基因，并能表达猪流行性腹泻病毒S截短蛋白融合猪CD40L蛋白的融合蛋白。使用该重组猪伪狂犬病毒制备的重组伪狂犬病活疫苗免疫猪后可以使猪获得抵抗猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病毒攻毒的免疫力。免疫效果较好，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗
本专利技术涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗。
技术介绍
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称奥耶斯基氏病(Aujeszky'sdisease,AD)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)所引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。猪是该病的天然宿主、主要储存宿主和传染源，PRV可以感染所有年龄的猪，年龄越小感染后发病越严重，死亡率也越高。哺乳仔猪感染后死亡率很高，可达100％，可出现腹泻、呕吐、四肢泳动等神经症状；断奶仔猪和育肥猪感染后主要表现为发热和呼吸道症状；成年猪感染后不发病或仅表现为体温升高等轻微症状，多呈隐形感染；妊娠母猪感染后会导致流产、产死胎、木乃伊胎等；该病还可引起种猪不育、公猪睾丸肿胀等。2011前后我国多个地区爆发猪伪狂犬病，给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。同期我国也出现了猪流行性腹泻的爆发流行。经过实验室检测发现，很多病例中存在猪伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的混合感染。两种病原感染后发病严重程度均与猪年龄呈负相关，均能引起仔猪腹泻呕吐。针对猪伪狂犬病和猪流行性腹泻，使用疫苗免疫可以显著降低因疾病感染而造成的经济损失，但尚无猪伪狂犬病和猪流行性腹泻病毒二联疫苗上市。因此开发一种能同时预防猪伪狂犬病和猪流行性腹泻的重组疫苗迫在眉睫。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组猪伪狂犬病毒，该重组猪伪狂犬病毒是经人工改造后得到的，通过基因编辑和重组技术缺失了伪狂犬病毒的主要致病基因TK、gI、gE和11K、28K基因，并在gI、gE、11K和28K基因缺失的位置插入了能够表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的截短片段并融合猪CD40L蛋白的融合蛋白。所构建的重组病毒对猪无致病性，其免疫原性被有效保留，使用该重组猪伪狂犬病毒制备的疫苗免疫猪后可以为猪提供抵抗猪伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的免疫力。本专利技术的另一目的在于提供上述重组猪伪狂犬病毒的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种重组猪伪狂犬病活疫苗，该疫苗由上述的重组猪伪狂犬病毒制成，其具有较好的免疫效果。本专利技术的另一目的在于提供一种制备上述重组猪伪狂犬病疫苗的方法。通过该方法制得的重组猪伪狂犬病活疫苗，具有较好的免疫效果。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种重组猪伪狂犬病毒，其保藏编号为CGMCCNo：16289。进一步地，所述重组伪狂犬病毒缺失如下基因：TK、gI、gE、11K和28K。进一步地，所述重组伪狂犬病毒能够表达猪流行性腹泻病毒S蛋白，所述S蛋白包含猪流行性腹泻病毒受体结合结构域。进一步地，所述重组伪狂犬病毒能够表达猪CD40L蛋白。进一步地，所述重组伪狂犬病毒所表达的外源蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合结构域与猪CD40L蛋白形成的融合蛋白。进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术提供的重组猪伪狂犬病毒是在伪狂犬病毒PRV-FJ株的基础上缺失了TK、gI、gE、11K和28K基因，经过基因编辑后得到本专利技术的重组猪伪狂犬病毒。该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)；保藏编号：CGMCCNO.16289。使用该重组病毒经鼻腔接种1日龄仔猪，不引起仔猪发病，对猪不具有致病性，此外，采用该重组猪伪狂犬病毒毒株制成的疫苗，经免疫原性试验验证，其gE抗体检测结果为阴性，gB抗体为阳性，并能诱导较高效价的猪伪狂犬病毒中和抗体和猪流行性腹泻病毒中和抗体，均能够有效抵抗猪伪狂犬病和猪流行性腹泻的侵袭。另一方面，本专利技术提供了上述重组猪伪狂犬病毒在制备猪用疫苗中的应用。其中，所述猪用疫苗为用于预防猪伪狂犬病和/或猪流行性腹泻的疫苗；优选的，所述疫苗为活疫苗。再一方面，本专利技术提供了一种重组猪伪狂犬病活疫苗，其包括如上所述的重组伪狂犬病毒以及稳定剂。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述稳定剂为明胶蔗糖保护剂。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述明胶蔗糖保护剂中含1％-3％明胶和10％蔗糖，余量为水。另一方面，本专利技术提供了一种如上所述的重组猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：步骤(a)：将如上所述的重组猪伪狂犬病毒接种传代细胞，收获病毒液；步骤(b)：将收获的病毒液与稳定剂混合。进一步地，所述制备方法还包括：步骤(c)：将病毒液与稳定剂的混合溶液经真空冷冻干燥制成成品的猪伪狂犬病活疫苗。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述稳定剂为明胶蔗糖保护剂。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，按质量体积比计，所述明胶蔗糖保护剂中含1％-3％明胶(即100ml明胶蔗糖保护剂含1-3g明胶)和10％蔗糖。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，在步骤(b)中，所述病毒液与稳定剂以等体积混合。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述传代细胞为ST细胞、BHK21细胞、MDBK细胞、VERO细胞、MDCK细胞、PK15细胞，293T细胞、293F细胞等，优选为BHK21细胞。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为免疫后28日PRVgB/gE抗体以及伪狂犬病毒中和抗体测定结果，注：gB/gE抗体检测，S/N值小于0.6为阳性，大于0.7为阴性，0.6至0.7为可疑。图2为PRV-FJ攻毒后体温变化曲线图，注：体温超过40.5℃为发热。图3为免疫后14日PEDV血清中和抗体检测结果。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1人工改造伪狂犬病毒1、毒株PRV-FJ株，由畜禽传染病四川省重点实验室从2015年福建猪伪狂犬发病猪病料中分离获得；发病猪主要表现为体温升高，食欲不佳，打喷嚏等症状。PRV-FJ株以107TCID50/头的剂量感染28日龄断奶仔猪，无神经症状，攻毒后7天全部死亡。PEDV-CV777株和SA014株由畜禽传染病四川省重点实验室保存提供。ST细胞与293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养(Gibco公司)。2、重组载体构建人工合成SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3SEQIDNO.4，然后将SEQIDNO.1定向克隆到pEGFP-C1载体的AseⅠ酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI，将SEQIDNO.2定向克隆到pEGFP-gI的MluⅠ酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI28K，将SEQIDNO.3克隆到p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No：16289。

【技术特征摘要】
1.一种重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo：16289。2.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒缺失如下基因：TK、gI、gE、11K和28K。3.根据权利要求2所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒能够表达猪流行性腹泻病毒S蛋白，所述S蛋白包含猪流行性腹泻病毒受体结合结构域。4.根据权利要求3所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒能够表达猪CD40L蛋白。5.根据权利要求4所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所表达的外源蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合结构域与猪CD40L蛋白形成的融合蛋白。6.根据权利要求5所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：周远成，代洪波，林艳，廖果，王雪涛，邝声耀，阴文奇，
申请(专利权)人：四川华神兽用生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51