本发明专利技术提供了一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法。蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法：循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，柱高为5～15cm，线性流速为200～500cm/h；在用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用pH值为5～6，电导率为20～100mS/cm的缓冲液洗涤柱床。本发明专利技术通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的填料，既降低了介质成本，又提高了纯化效率；还通过增加中间清洗的步骤提高了对HCP、DNA的去除能力，进而提高了阴离子交换层析去病毒的能力。
【技术实现步骤摘要】
蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法
本专利技术涉及抗体纯化领域，尤其是涉及一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法。
技术介绍
生物制药行业迅速发展，连续生产工艺以高效、快速和更稳定的特性越来越被关注。连续生产技术在生物制药行业中的应用开始于21世纪初，其越来越多地被应用以取代传统的批次生产方法，来提高一致性、降低生产成本和缩短交货期。在生物制药上游工艺中，连续生产始于灌流培养的方式，一些不稳定的生物制品已经在上游实现了的商业化的连续生产，如凝血因子VII和凝血因子VIII。相比于上游的灌流培养工艺，连续的下游生产工艺更复杂，而连续层析步骤具有更大的挑战性。常规的做法是用多柱连续层析的方式，把相同的层析填料填充在多根层析柱中，在上样阶段优化条件使得层析填料达到满载，提高效率，节省填料和缓冲液的用量。在商业化的单克隆纯化工艺中，通常利用蛋白A亲和层析来捕获细胞培养收获液中的目标物，而蛋白A填料的价格又异常昂贵。传统的蛋白A亲和层析工艺对载量的有效利用率很低，所以连续层析技术在单抗的捕获阶段就显得更加实用。连续层析技术也带来相应的挑战，更多层析柱之间的连接带来系统设计的复杂性，需要相应的阀路设计满足来工艺的需求。为了满足多柱位连续层析，需要特殊设计的层析系统，常见的有：GE公司的3柱位或4柱位的运行PCC连续流层析设备，Pall公司的使用一次性管路及多柱位的CadenceBioSMB工业系统，以及ChromaCon公司的2柱位ContichromCUBE连续流层析设备。可见，多柱位连续层析的方式存在介质成本高的问题。为解决以上问题，生产厂家现在已经广泛采用“每批次多次循环”的方式处理高滴度细胞培养液。然而，这种放大设计显著延长了纯化时间、缓冲液消耗和洗脱产品的体积，这限制了这种方法在工业生产中的广泛应用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法，该方法通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率。本专利技术的第二目的在于提供一种抗体的纯化方法，该纯化方法通过在蛋白A亲和层析过程中增加中间清洗的步骤提高了对HCP、DNA的去除能力，进而提高了阴离子交换层析去病毒的能力。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法为：循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelectLX、AmsphereA3或PraestoJettedA50，填料的装柱高度为5～15cm，工艺运行线性流速为200～500cm/h。以上方法为单柱多次循环的纯化工艺，主要通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率。另外，本专利技术的另一个优势是：无需增加额外工艺步骤即可提高单位时间单位填料体积的处理量，替代现有工艺的成本低，对抗体的生产链没有影响，且工艺稳健、可靠。综上，与现有技术相比，本专利技术的以上工艺具有填料利用率高、单位时间单位填料体积的处理量高、成本低、工艺稳健可靠等优点。本专利技术中，MabSelectLX、AmsphereA3、PraestoJettedA50填料通常为固定的厂家，分别为GEHealthCare公司、JSR公司和Purolite公司。本专利技术中，填料的装柱高度在5～15cm范围内任意选择，例如5cm、5.5cm、6.0cm、6.5cm、7.0cm、7.5cm、8.0cm、8.5cm、9.0cm、9.5cm、10.0cm、10.5cm、11.0cm、11.5cm、12.0cm、12.5cm、13.0cm、14.0cm、14.5cm或15.0cm等。本专利技术中，工艺运行线性流速在200～500cm/h范围内任意选择，例如200cm/h、250cm/h、300cm/h、350cm/h、400cm/h、450cm/h或500cm/h等。本专利技术的纯化方法主要适用于抗体的纯化，尤其是单抗的纯化，尤其是中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。在以上基础上，工艺的其他条件还可以进一步改进，具体如下。优选地，所述填料的装柱高度为5～12cm，优选5～10cm，更优选6～10cm。优选地，所述工艺运行线性流速为300～500cm/h，优选300～400cm/h。填料的装柱高度和工艺运行线性流速是影响纯化效率的关键参数，经优化，采用以上条件效率大幅提高，单位时间单位填料体积的处理量显著提高。优选地，所述蛋白A亲和层析的方法为：在上样之后和用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用中间清洗缓冲液洗涤柱床；所述中间清洗缓冲液为：pH值为5-6，电导率为20-100mS/cm的缓冲液。以上方法利用：pH值为5-6，电导率为20-100mS/cm的缓冲液清洗样品，去除其中的HCP、DNA。相比无中间清洗步骤的层析工艺，本专利技术对HCP、DNA的去除率有显著改进，所得洗脱液中HCP含量低于1000ppm，残留DNA的含量低于100pg/mg。中间清洗缓冲液的pH值和电导率使去除HCP、DNA的关键参数，pH可采用5-6范围内的任意值，例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0等，电导率可采用20-100mS/cm范围内的任意值，例如20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm、100mS/cm等。在以上增加中间清洗的基础上，还可以进行以下改进：优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系。这些缓冲液不会引来外源性杂质，而且原料易得。对于缓冲液的浓度没有特定限定，例如50mMNaAc-HAc或1MNaAc-HAc等。优选地，所述缓冲液为用氯盐调整电导率的缓冲液，所述氯盐优选氯化钠。当然，也可以采用其他溶解性好的盐调节电导率，且不仅限于加入一种盐，或者多种组合后加入。经考察，在以上填料的层析柱中增加中间清洗的步骤，可达到事半功倍的效果，对HCP、DNA的去除能力显著提高。优选地，所述中间清洗缓冲液的pH值为5.5-6，优选5.5-5.8。优选地，电导率为50-100mS/cm，优选50-80mS/cm。优选地，所述蛋白A亲和层析的流程依次为：消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤、所述中间清洗缓冲液洗涤、平衡液洗涤、所述洗脱液洗脱目标抗体。优选地，所述平衡液为Tris-HCl+150～160mMNaCl、pH7.2～7.6的缓冲液，优选50～55mMTris-HCl。优选地，所述目标抗体为CHO细胞表达的单抗时，所述洗脱液为NaAc-HAc、pH3.0～3.5的缓冲液，优选50～55mMNaAc-HAc。优选地，在所述蛋白A亲和层本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法，其特征在于，循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，填料的装柱高度为5～15cm，工艺运行线性流速为200～500cm/h。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法，其特征在于，循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelectLX、AmsphereA3或PraestoJettedA50，填料的装柱高度为5～15cm，工艺运行线性流速为200～500cm/h。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标抗体为中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述填料的装柱高度为5～12cm，优选5～10cm，更优选6～10cm；优选地，所述工艺运行线性流速为300～500cm/h，优选300～400cm/h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白A亲和层析的方法为：在上样之后和用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用中间清洗缓冲液洗涤柱床；所述中间清洗缓冲液为：pH值为5～6，电导率为20～100mS/cm的缓冲液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为醋酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系；优选地，所述缓冲液为用氯盐调整电导率的缓冲液，所述氯盐优选氯化钠。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述中间清洗缓冲液的pH值为5.5～6，...
【专利技术属性】
技术研发人员：金雄华，汤炜，梁泊宁，徐志豪，
申请(专利权)人：杭州奕安济世生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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