一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用技术

本发明专利技术公开了一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，包括以下步骤：a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养。利用脐带间充质干细胞重层化培养的方法产物制备生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，培养上清通过特殊的低温真空冻干技术制成活性因子；重层化细胞层与洁净膜组合制成生物活性膜。还公开了生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。本发明专利技术的有益效果是：可以获得高水平的活性因子和重层化细胞层。并且此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，通过重层化细胞层与洁净膜结合可以制成生物活性膜。

A method of umbilical cord mesenchymal stem cells regeneration and its application

The present invention discloses a method of umbilical cord mesenchymal stem cells re-layer culture, which includes the following steps: a) isolation, extraction and cultivation of healthy human umbilical cord mesenchymal stem cells; b) re-layer culture of umbilical cord mesenchymal stem cells by serum-free re-layer medium. The method of preparing bioactive membrane by using the product of the method of umbilical cord mesenchymal stem cells re-layered culture includes culture supernatant and re-layered cell layer, the culture supernatant is made into active factor by special cryogenic vacuum freeze-drying technology, and the bio-active membrane is made by combining the re-layered cell layer and clean membrane. The application of bioactive membranes in the preparation of biologically active products is also disclosed. The beneficial effect of the present invention is that a high level of active factors and a layered cell layer can be obtained. Moreover, this method obtains higher purity and stability of active factors through special cryogenic and vacuum freeze-drying technology. Bioactive membranes can be made by combining the layers of cells with clean membranes.

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用
本专利技术涉及一种细胞培养
，特别涉及一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用。
技术介绍
脐带间充质干细胞是一种分离自健康婴儿胎盘的成体干细胞。脐带间充质干细胞能够分泌许多细胞因子如EGF、bFGF、TGF-β、TGF-α、HGF、IGF、VEGF、KGF等及许多干细胞外泌体，还能分泌collagenⅠ和collagenⅢ。脐带间充质干细胞及其分泌活性因子在再生医学领域已经得到广泛的研究和应用。脐带间充质干细胞是一种贴壁依赖性细胞，而且由于接触抑制，只能单层培养，传统的贴壁培养的制备工艺复杂，需要不断地进行传代，分泌的活性因子水平也较低。大大影响了脐带间充质干细胞及其活性因子的产品开发，而且传统的制备工艺均是在含血清、含抗生素的条件下进行，会引入许多风险因素，影响活性因子的纯度，给产品开发带来一系列的困难。综上，现有技术存在如下技术问题：一是细胞培养中获取的活性因子水平较低；二是细胞培养过程中存在许多风险因素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法在于通过特殊的无血清重层化培养基来培养脐带间充质干细胞，此方法培养的细胞能够分泌更高水平的活性因子，并且能够获得重层化的细胞层，大大提高使用率。本专利技术的另一个目的在于提供一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法为无血清和无抗生素培养，风险因素大大减小。本专利技术的另一个目的在于一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，且重层化细胞层与洁净膜组合可以制成生物活性膜。本专利技术的另一个目的在于一种脐带间充质干细胞重层化培养的产物在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有极高的社会及经济效益。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，包括以下步骤：a)分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；b)通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；所述的步骤b)中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、TGF-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；TGF-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、抗坏血酸含量为10～100ng/mL；所述的步骤b)中，重层化培养方法如下：将步骤a)中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14～15天获取重层化培养细胞层。优选地，所述的步骤b)中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、80ng/mLPDGF-BB、20ng/mLbFGF、10ng/mLTGF-β1、10ng/mLEGF、3.0mg/mL转铁蛋白和100ng/mL抗坏血酸。利用上述方法制得的产物制备活性因子和/或生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，所述的活性因子的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层的培养上清通过45μm的滤网过滤后，通过3kD的滤膜进行超浓缩至原上清体积的1/20，得到浓缩液，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过1℃/min程序降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存；所述的生物活性膜的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层用镊子掀起，防止蜷曲，平铺至洁净膜上，加入PBS，4℃保存，即得生物活性膜。所述步骤b)中，冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15～20％w/w，优选15％w/w。所述的洁净膜是无纺布、蚕丝膜、天丝膜、生物纤维膜和超导膜中的一种。所述的生产过程中不添加任何的血清和抗生素。上述方法制备的活性因子在制备生物学活性功能的产品的应用。如化妆品或保健品中应用。上述方法制备的生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。如化妆品或保健品中应用。本专利技术中，“活性因子”的定义为：具有生物学活性的因子，如EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等细胞因子及干细胞分泌的外泌体等。“具有生物学活性功能产品”的定义为：含有EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等细胞因子及干细胞分泌的外泌体等生物活性因子且具备抗衰、护肤等功能的产品，如精华液、面膜等化妆品和保健品。本专利技术通过独创的重层化培养体系，解决了现有技术存在的技术问题，并且带来如下技术效果：1)通过特殊无血清重层化培养基培养脐带间充质干细胞，获得高水平的活性因子和重层化细胞层。2)通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，通过重层化细胞层与洁净膜结合可以制成生物活性膜。3)通过此方法生产的脐带间充质干细胞重层化培养在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有更高的社会及经济效益。附图说明图1为脐带间充质干细胞培养图。图2为脐带间充质干细胞流式结果图；(左侧4个图为阳性指标流式峰图，第一个为CD90，第二个为CD73，第三个为CD105，第四个为CD29；右侧5个图为阴性指标流式峰图，第一个为CD45，第二个为CD34，第三个为CD79a，第四个为CD14，第五个为HLA-DR)。图3为脐带间充质干细胞分化结果图；(最左侧上下两图为脐带间充质干细胞成骨分化图，上图为成骨分化，明显有骨生成，下图为对照图，明显无骨生成；中间上下两图为脐带间充质干细胞成脂分化图，上图为成脂分化，明显有脂肪颗粒生成，下图为对照组，明显无脂肪颗粒生成；最右侧上下两图为脐带间充质干细胞成软骨分化，上图为成软骨分化图，明显有软骨组织生成，下图为对照组，明显无软骨组织生成)。图4为脐带间充质干细胞重层化培养图；(左侧图为重层化培养诱导Day0的脐带间充质干细胞状态；中间图为重层化培养诱导Day14的脐带间充质干细胞状态，明显可见有细胞重叠；右侧图为重层化培养后剥离出来的细胞层)。图5a和图5b为脐带间充质干细胞重层化培养α‐SMA表达图；(图5a为重层化诱导指标流式检测的同型对照，排除抗体非特异性结合；图5b为重层化诱导的指标α‐SMA流式检测图，如图显示为高表达)。图6a和图6b为活性因子分泌比较图；(图6a和图6b为脐带间充质干细胞重层化培养培养上清中细胞因子含量与传统单层培养比较；图6a为EGF、bFGF、IGF、VEGF、PGE2、CollagenⅠ、CollagenⅡ比较，如图显示，黑色柱子为传统贴壁方法培养的，白色柱子为重层化培养，重层化培养的上清细胞因子含量明显高于传统贴壁方法；图6b为HGF、KGF、TGF‐β较，如图显示，黑色柱子为传统贴壁方法培养的，白色柱子为重层化培养，重层化培养的上清细胞因子含量明显高于传统贴壁方法)。图7a和图7b为HDF增殖实验结构图；(图7a为脐带间充质干细胞重层化培养后提取的干细胞活性因子对HDF细胞增殖的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF‑BB、 bFGF、TGF‑β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF‑BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；TGF‑β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL、抗坏血酸含量为10~100 ng/mL；所述的步骤b）中，重层化培养方法如下：将步骤a）中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14~15天获取重层化培养细胞层。

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、TGF-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；TGF-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、抗坏血酸含量为10~100ng/mL；所述的步骤b）中，重层化培养方法如下：将步骤a）中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14~15天获取重层化培养细胞层。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、80ng/mLPDGF-BB、20ng/mLbFGF、10ng/mLTGF-β1、10ng/mLEGF、3.0mg/mL转铁蛋白和100ng/mL抗坏血酸。3.利用权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沐芸，刘云城，曾桂芳，梁晓，彭浩，陈康卓，
申请(专利权)人：个体化细胞治疗技术国家地方联合工程实验室深圳，深圳科诺医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：广东,44