甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，包括如下步骤：1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；2)对步骤1)得到的纯化后的病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；3)将步骤1)得到的纯化后的病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。该检测方法具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，不仅可使用目前存在市场上的所有类型PCR仪器，而且能快速地对甜菜夜蛾核型多角体病毒进行定性定量检测，为生产提供可靠的保证产品质量的方法。

Qualitative and Quantitative Detection of Spodoptera exigua Nuclear Polyhedrosis Virus and Its Application

The invention provides a qualitative and quantitative detection method for the Nucleopolyhedrosis virus of Spodoptera exigua, including the following steps: 1) purifying virus particles by combining sedimentation method with differential centrifugation, or combining sedimentation method, differential centrifugation method and density gradient centrifugation method; 2) purifying virus particles obtained by step 1) using enzyme-linked immunosorbent assay or PCR specific primer method. The purified virus particles were prepared into a certain concentration of virus suspension, and the content of virus particles was quantitatively determined by electron microscopy or microscopy counting. The detection method has the advantages of simple operation, fast, good specificity, high sensitivity and low hardware requirements. It can not only use all types of PCR instruments currently on the market, but also detect the Nucleopolyhedrosis virus of Spodoptera exigua qualitatively and quantitatively quickly, providing reliable methods to ensure product quality for production.

【技术实现步骤摘要】
甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法及应用
本专利技术属于昆虫病毒生物农药检测
，具体涉及一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法及应用。
技术介绍
甜菜夜蛾(Beetarmyworm)学名SpodopteraexiguaHiibner，俗称白菜褐夜蛾，隶属于鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性分布、间歇性大发生的以危害蔬菜为主的杂食性害虫，对大葱、甘蓝、大白菜、芹菜、菜花、胡萝卜、芦笋、蕹菜、苋菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥兰、番茄、菜心、小白菜、青花菜、菠菜、萝卜等蔬菜都有危害。甜菜夜蛾的发生规律、危害特点如下：初龄幼虫在叶背群集吐丝结网，食量小；3龄后，分散为害，食量大增，昼伏夜出，危害叶片成孔缺刻，严重时，可吃光叶肉，仅留叶脉，甚至剥食茎杆皮层。幼虫可成群迁飞，稍受震扰吐丝落地，有假死性；3～4龄后，白天潜于植株下部或土缝，傍晚移出取食为害；一年发生6～8代，7～8月发生多，高温、干旱年份更多，常和斜纹夜蛾混发，对叶菜类蔬菜威胁甚大。近年来，随着全球气候变暖和其它因素的影响，甜菜夜蛾的发生和危害呈逐年加重的趋势。甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)为杆状病毒科核型多角体病毒属病毒，形态为四边形到近似圆形，单个多角体内包埋多个病毒粒子，单个病毒粒子直径约为1.32nm，多角体病毒大小33.2～63.2nm×153～285nm，病毒核酸为双链环状DNA，MW：208×107d，基因组大小135.6kb。甜菜夜蛾核型多角体病毒是一种新型活体病毒杀虫剂，其杀虫机理是病毒经害虫取食后直接作用于害虫幼虫的脂肪体和中肠细胞核，并迅速复制，导致幼虫染病死亡；甜菜夜蛾幼虫感染病毒后，很快体色由青绿色逐渐变为黄绿色，最后变为灰白色，体节肿胀，食欲不振，直至死亡；死亡后表皮脆弱，容易液化。该病毒通过病虫粪便及死虫感染其他健康甜菜夜蛾，在田间引起“瘟疫”，导致大量幼虫死亡，该病毒专一性强，只对靶标害虫有效，不影响害虫的天敌，不污染环境，持效期长，是防治目标害虫的主要生物制剂之一，且安全环保，不杀伤害虫天敌，如草蛉、瓢虫、马蜂等，从而达到长期有效控制害虫种群增长的目的，持效期长达10～30天。随着甜菜夜蛾规模化饲养技术的发展，病毒制剂的成熟，SeNPV杀虫剂的产业化和田间应用推广的不断发展，需要有更快更简单的方法对其有效成分甜菜夜蛾核型多角体病毒进行定性定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，该方法具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，不仅可使用目前存在市场上的所有类型PCR仪器，而且能快速地对甜菜夜蛾核型多角体病毒进行定性定量检测。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是提供了一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，包括如下步骤：1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；2)将纯化后的部分病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；3)甜菜夜蛾核型多角体病毒定性确认后，将纯化后的剩余病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。进一步的，所述步骤1)中沉降法与差速离心法结合对病毒粒子纯化的过程：将感染甜菜夜蛾核型多角体病毒的病死虫磨碎后加入等量的水，用双层纱布过滤后收集滤液，将滤液放入离心机在4℃、500～1500r/min条件下离心5～10min，再收集上清液在4℃、4000～8000r/min离心10～40min，收集沉淀，然后加水溶解沉淀，重复离心3～7次，以肉眼看不到杂质为准，即得纯化的病毒粒子。进一步的，所述步骤1)中沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合对病毒粒子纯化的过程：收集人工感染甜菜夜蛾核型多角体病毒的病死幼虫，称重后捣碎，在虫体中按质量比1：30～1：50加入磷酸盐缓冲溶液，纱布过滤，滤液经1500～4000r/min差速离心3～7次得到纯净的多角体粗制品，再将多角体病毒粗制品经质量分数为45～70％蔗糖密度梯度离心，取出病毒带，洗去蔗糖得纯净的多角体，再用质量分数45～70％蔗糖梯度在离心力41000g，温度4℃条件下超速离心2h，即得纯化的病毒粒子。进一步的，所述步骤2)中酶联免疫法对病毒粒子定性鉴别的过程包括如下步骤：a)抗血清的制备称取纯化的病毒60mg用无菌生理盐水配成6mL病毒悬浮液，免疫雄性家兔，选用体重2.5kg的健康雄性家兔，进行静脉注射5次，剂量分别为2mg/次、4mg/次、8mg/次、16mg/次、25mg/次，每次间隔4d，末次注射一周后，杀兔采血，凝血后采集血清，加叠氮钠防腐，终浓度为1％，经对流免疫电泳和琼脂双扩散试验鉴定，并测定凝集效价；b)抗原：病毒标样稀释液SeNPV1.0×103PIB/mL，1.0×102PIB/mL，待检水悬浮液，稀释成1000倍，10000倍；c)辣根过氧化物酶标记家兔抗SeNPV的制备采用饱和硫酸铵沉淀透析法提取IgG，以分光光度计测定IgG含量，并测其凝集效价，然后用辣根过氧化物酶按二步法制备酶标IgG，测定酶和IgG的结合量，算出酶与IgG的克分子比，用琼脂双扩散试验和对流免疫电泳鉴定酶标IgG，在形成单一沉淀线后加酶底物邻苯二胺进行显色观察辣根过氧化物酶的IgG的结合程度；d)ELISA检测先取上述步骤a)制备的特异性抗血清吸附于固相载体，聚苯乙烯微量滴定板作固相载体；然后，取含有抗原的待检液，与致敏的固相载体温育后清洗，同时采用步骤b)病毒标样稀释液进行对照；再加入步骤c)辣根过氧化物酶标记的特异性抗体，温育后清洗；最后，加入新配制的邻苯二胺，室温下反应30min，滴硫酸溶液50μL，终止反应，出现黄色为阳性，则待检测样品为甜菜夜蛾核型多角体病毒。进一步的，所述步骤2)中PCR特异引物法对病毒粒子定性鉴别的过程包括如下步骤：a)甜菜夜蛾核型多角体病毒形态确定纯化的甜菜夜蛾核型多角体病毒悬液在光学显微镜下观察，病毒为大小均一的四边形到近似圆形的粒子，有折光点；b)甜菜夜蛾核型多角体病毒核酸提取取纯化的甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮液适量，加入病毒悬浮液1/3体积的3倍碱解液，37℃水浴1～2min，加入病毒悬浮液1/2体积的pH8.0的TE缓冲液，以4000～8000r/min离心5～10min，收集上清液，上清液中加入5～10μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，45～50℃水浴2～4h，再加入50～100μL10％的SDS，45～50℃水浴30～60min，之后加入等体积的苯酚，轻微摇匀5min，抽提1次，收集上清液，上清液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，轻微摇匀，抽提2～5次，收集上清液，再在上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃静置4～12h，以12000r/min离心10min，沉淀干燥后加入20～100μLpH8.0的TE缓冲液，悬浮在TE缓冲液中即为甜菜夜蛾核型多角体病毒核酸；c)甜菜夜蛾核型多角体病毒核酸PCR检测采用PCR检测引物对扩增甜菜夜蛾核型多角体病毒DNA片段，并用浓度为1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测，验证其片段大小，片段大小一致，则检测样品为甜菜夜蛾核型多角体病毒。进一步的，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；2)将纯化后的部分病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；3)甜菜夜蛾核型多角体病毒定性确认后，将纯化后的剩余病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。

【技术特征摘要】
1.甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；2)将纯化后的部分病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；3)甜菜夜蛾核型多角体病毒定性确认后，将纯化后的剩余病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。2.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤1)中沉降法与差速离心法结合对病毒粒子纯化的过程：将感染甜菜夜蛾核型多角体病毒的病死虫磨碎后加入等量的水，用双层纱布过滤后收集滤液，将滤液放入离心机在4℃、500～1500r/min条件下离心5～10min，再收集上清液在4℃、4000～8000r/min离心10～40min，收集沉淀，然后加水溶解沉淀，重复离心3～7次，以肉眼看不到杂质为准，即得纯化的病毒粒子。3.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤1)中沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合对病毒粒子纯化的过程：收集人工感染甜菜夜蛾核型多角体病毒的病死幼虫，称重后捣碎，在虫体中按质量比1：30～1：50加入磷酸盐缓冲溶液，纱布过滤，滤液经1500～4000r/min差速离心3～7次得到纯净的多角体粗制品，再将多角体病毒粗制品经质量分数为45～70％蔗糖密度梯度离心，取出病毒带，洗去蔗糖得纯净的多角体，再用质量分数45～70％蔗糖梯度在离心力41000g，温度4℃条件下超速离心2h，即得纯化的病毒粒子。4.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤2)中酶联免疫法对病毒粒子定性鉴别的过程包括如下步骤：a)抗血清的制备称取纯化的病毒60mg用无菌生理盐水配成6mL病毒悬浮液，免疫雄性家兔，选用体重2.5kg的健康雄性家兔，进行静脉注射5次，剂量分别为2mg/次、4mg/次、8mg/次、16mg/次、25mg/次，每次间隔4d，末次注射一周后，杀兔采血，凝血后采集血清，加叠氮钠防腐，终浓度为1％，经对流免疫电泳和琼脂双扩散试验鉴定，并测定凝集效价；b)抗原：病毒标样稀释液SeNPV1.0×103PIB/mL，1.0×102PIB/mL，待检水悬浮液，稀释成1000倍，10000倍；c)辣根过氧化物酶标记家兔抗SeNPV的制备采用饱和硫酸铵沉淀透析法提取IgG，以分光光度计测定IgG含量，并测其凝集效价，然后用辣根过氧化物酶按二步法制备酶标IgG，测定酶和IgG的结合量，算出酶与IgG的克分子比，用琼脂双扩散试验和对流免疫电泳鉴定酶标IgG，在形成单一沉淀线后加酶底物邻苯二胺进行显色观察辣根过氧化物酶的IgG的结合程度；d)ELISA检测先取上述步骤a)制备的特异性抗血清吸附于固相载体，聚苯乙烯微量滴定板作固相载体；然后，取含有抗原的待检液，与致敏的固相载体温育后清洗，同时采用步骤b)病毒标样稀释液进行对照；再加入步骤c)辣根过氧化物酶标记的特异性抗体，温育后清洗；最后，加入新配制的邻苯二胺，室温下反应30min，滴硫酸溶液50μL，终止反应，出现黄色为阳性，则待检测样品为甜菜夜蛾核型多角体病毒。5.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR特异引物法对病毒粒子定性鉴别的过程包括如下步骤：a)甜菜夜蛾核型多角体病毒形态确定纯化的甜菜夜蛾核型多角体病毒悬液在光学显微镜下观察，病毒为大小均一的四边形到近似圆形的粒子，有折光点；b)甜菜夜蛾核型多角体病毒核酸提取取纯化的甜菜夜蛾核型多角体病毒悬浮液适量，加入病毒悬浮液1/3体积的3倍碱解液，37℃水浴1～2min，加入病毒悬浮液1/2体积的pH8.0的TE缓冲液，以4000～8000r/min离心5～10min，收集上清液，上清液中加入5～10μL浓度20mg/mL的蛋白酶K，45～50℃水浴2～4h，再加入50～100μL10％的SDS，45～50℃水浴30～60min，之后加入等体积的苯酚，轻微摇匀5min，抽提1次，收集上清液，上清液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，轻微摇匀，抽提2～5次，收集上清液，再在上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃静置4～12h，以12000r/min离心10min，沉淀干燥后加入20～100μLpH8.0的TE缓冲液，悬浮在TE缓冲液中即为甜菜夜蛾核型多角体病毒核酸；c)甜菜夜蛾核型多角体病毒核酸PCR检测采用PCR检测引物对扩增甜菜夜蛾核型多角体病毒DNA片段，并用浓度为1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测，验证其片段大小，片段大小一致，则检测样品为甜菜夜蛾核型多角体病毒。6.如权利要求5所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述PCR检测引物对扩增甜菜夜蛾核型多角体病毒DNA片段中PCR反应体系组成为DNasemix18μL，10mM的正反向引物各0.5～1μL及病毒DNA模板0.5～2μL；PCR反应程序为95℃3min，1个循环，95℃30s，52～60℃30～60s，72℃30s～2.5min，30～35个循环，72℃3min，16℃1min，1个循环。7.如权利要求5所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈娇，陶佩文，尹宜农，林春鸿，杨未，胡家鑫，杨婷，张恒，刘取，贾军，彭晖，
申请(专利权)人：武汉武大绿洲生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42