葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术专利公开了一种葡萄病毒A的实时荧光定量RT‑PCR检测方法，包括采用实时荧光定量RT‑PCR对葡萄病毒A进行检测的核苷酸对以及匹配的检测试剂盒，本发明专利技术设计在不同季节可高效、准确地检测出田间葡萄样品不同部位的携毒情况，为葡萄枝条和苗木等繁殖材料的无毒繁育及海关进出口检疫提供有力的技术支持。

Real-time fluorescence quantitative RT-PCR detection of grape virus A and its kit

The invention patent discloses a real-time fluorescent quantitative RT_PCR detection method for grape virus A, including a pair of nucleotides for detection of grape virus A by real-time fluorescent quantitative RT_PCR and a matching detection kit. The invention is designed to detect the carrying situation of different parts of field grape samples efficiently and accurately in different seasons, and is a reproductive material such as grape branches and seedlings. Non-toxic breeding and customs import and export quarantine provide strong technical support.

【技术实现步骤摘要】
葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒
本专利技术专利涉及基于分子生物学的检验检疫
，尤其涉及一种葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。
技术介绍
葡萄是中国重要的果树之一，2015年葡萄产量位于全国水果产量排名第四位。病毒病是葡萄上的一类重要病害，其中葡萄皱木复合病(Rugosewoodcomplex,RW)在葡萄上普遍发生，可造成葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等症状，根据其在植物上的症状表现可分为克勃茎沟病、LN33茎沟病、栓皮病和沙地葡萄茎痘病4种不同的类型。葡萄皱木复合病主要由线性病毒科(Flexiviridae)葡萄病毒属(Vitivirus)病毒引起，其中葡萄病毒A(GrapevinevirusA，GVA)是克勃茎沟病的病原，也是葡萄病毒属的代表种，其还与南非葡萄西拉衰退病有关。GVA为单链RNA病毒，病毒粒子呈线状，全长800nm，其基因组全长约7349nt，共编码5个开放阅读框(ORF1-5)，分别编码复制蛋白、寄主侵染或粉蚧传播相关蛋白、运动蛋白、外壳蛋白和核酸结合蛋白。目前，GVA已在南非、意大利、法国、澳大利亚、美国以及中国等多个国家和地区普遍发生，其可由多种粉蚧在葡萄植株间传播危害，还可通过介体昆虫或机械传播至草本寄主，发生危害趋势不断加重。长期以来，由于葡萄病毒A(GrapevinevirusA，GVA)，即GVA在植株体内的分布不均衡性和复杂性，以及现有核酸提取技术和检测技术灵敏度的有限性，致使对GVA的准确、快速检测已成为整个葡萄无毒苗繁育及海关检疫的重要难题。培育和种植无病毒苗木是目前防治葡萄病毒病的主要手段，病毒检测是其中的关键环节，同时也是掌握病害发生流行、制定防控措施的重要依据。目前国内外常用的葡萄病毒检测方法包括ELISA血清学检测和RT-PCR分子检测，ELISA方法简单快速但灵敏度略低于分子检测方法，且目前国内还没有GVA市售抗血清，需从国外进口，中国农业科学院果树研究所也制备了GVA多克隆抗体，可以对GVA进行特异性检测，但基于病毒株系差异等原因导致抗体对GVA不同株系的检测效果存在较大差异，在检测田间葡萄样品时只有少数样品能够成功检测。RT-PCR是目前应用最广泛的葡萄病毒检测方法，目前对GVA的检测使用最多的也是RT-PCR检测方法，其灵敏度高于ELISA，但其在灵敏度和检测范围上还存在一定不足：在检测某些病毒含量低的植株或某些季节和部位葡萄样品时，存在无法检出的情况，因此亟需建立更加灵敏高效的葡萄病毒检测技术。实时荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、检测范围广、重复性好以及可定量等优点，在多种果树病毒检测中灵敏度普遍达常规RT-PCR的100倍以上，具有很好的应用前景。目前国际上已形成对葡萄卷叶伴随病毒、皱木复合相关病毒、扇叶病毒、斑点病毒等主要葡萄病毒的RT-qPCR技术，但对GVA等其它葡萄病毒RT-qPCR的检测方法还未见报道。专利技术专利内容为了解决上述问题，本专利技术建立了一种葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法，在不同季节可高效、准确地检测出田间葡萄样品不同部位的携毒情况，为葡萄枝条和苗木等繁殖材料的无毒繁育及海关进出口检疫提供有力的技术支持。为了实现本专利技术专利的目的，拟采用以下技术：一种用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，其特征在于，包括成对匹配使用的正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC-3’和反义引物QA2R:5’–AGGACCTACTATATCTACCTC-3’，所述正义引物QA2F与反义引物QA2R扩增获得的目标片段为100bp。上述设计的用于检测葡萄病毒A的核苷酸对可应用于葡萄病毒A检测试剂盒中。基于设计方案中提出的用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，本专利技术还提供了一种葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法，具体方法如下：步骤1)：选取葡萄样品，提取葡萄样品的总RNA；步骤2)：采用RNA直接反转录的方法对步骤1)中获得RNA进行cDNA合成，获得cDNA1；步骤3)：采用去除基因组DNA反转录的方法对步骤1)中获得RNA进行cDNA合成，获得cDNA2；步骤4)：以正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC-3’和反义引物QA2R：5’–AGGACCTACTATATCTACCTC-3’为检测引物组，以步骤2)合成的cDNA1或步骤3)中合成的cDNA2为扩增模板，采用RT-qPCR扩增方法对葡萄样品中的葡萄病毒A进行检测；所述RT-qPCR扩增方法的反应提体系如下：向25μL反应体系中加入2×SYBRGreenⅠqPCRMix12.5μL、10μmol·L-1的正义引物QA2F0.5μL、10μmol·L-1的反义引物QA2R0.5μL、DNase/RNaseFreedH2O10.5μL和cDNA1μL；所述RT-qPCR扩增方法的反应条件如下：95℃预变性3min，50～62℃15s，60℃15s，72℃20s，记录荧光信号，40个循环；熔解曲线温度范围60～95℃，每5s增加温度0.5℃，记录荧光信号；步骤5)：根据步骤4)记录的荧光信号进行葡萄病毒A的检测结果判定。基于设计方案中提出的用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，本专利技术提供了一种用于检测葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：组分1)：正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC-3’、反义引物QA2R：5’–AGGACCTACTATATCTACCTC-3’；5×MLV-RTbuffer、10mMdNTPs、200U/μLM-MLV、DEPC水；5×gDNAEraserbuffer、gDNAEraser、PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ，RTPrimerMix、5×PrimeScriptbuffer、RNaseFreedH2O；2×SYBRGreenⅠqPCRMix、DNase/RNaseFreedH2O；10×PCRBuffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000；组分2)：阴性对照，选择健康无毒的葡萄叶片样品，提取RNA，溶解于DEPC水中，获得阴性对照；组分3)：阳性对照，选择经常规RT-PCR检测为阳性的葡萄叶片样品，提取RNA，溶解于DEPC水中，获得阳性对照。上述技术方案的优点在于：1、本专利技术提供的用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，可用于葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测，在不同季节可高效、准确地检测出田间葡萄样品不同部位的携毒情况，为葡萄枝条和苗木等繁殖材料的无毒繁育及海关进出口检疫提供有力的技术支持。2、本专利技术提供一种葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法，以本方案中设计的正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC-3’及反义引物QA2R：5’–AGGACCTACTATATCTACCTC-3’为检测引物对，采用GVASYBRGreenⅠ染料法RT-qPCR检测技术，在不同季节实现了对田间葡萄样品不同部位携毒情况的高效、准确检测，其检出率及检测准确性接近于探针法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，其特征在于，包括成对匹配使用的正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC‑3’和反义引物QA2R:5’–AGGACCTACTATATCTACCTC‑3’，所述正义引物QA2F与反义引物QA2R扩增获得的目标片段为100bp。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，其特征在于，包括成对匹配使用的正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC-3’和反义引物QA2R:5’–AGGACCTACTATATCTACCTC-3’，所述正义引物QA2F与反义引物QA2R扩增获得的目标片段为100bp。2.根据权利要求1所述的用于检测葡萄病毒A的核苷酸对，其特征在于，所述用于检测葡萄病毒A的核苷酸对可应用于检测葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒中。3.一种葡萄病毒A的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：选取葡萄样品，提取葡萄样品的总RNA；步骤2)：采用RNA直接反转录的方法对步骤1)中获得RNA进行cDNA合成，获得cDNA1；步骤3)：采用去除基因组DNA反转录的方法对步骤1)中获得RNA进行cDNA合成，获得cDNA2；步骤4)：以正义引物QA2F：5’–CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC-3’和反义引物QA2R：5’–AGGACCTACTATATCTACCTC-3’为检测引物组，以步骤2)合成的cDNA1或步骤3)中合成的cDNA2为扩增模板，采用RT-qPCR扩增方法对葡萄样品中的葡萄病毒A进行检测；所述RT-qPCR扩增方法的反应提体系如下：向25μL反应体系中加入2×SYBRGreenⅠqPCRMix12.5μL、10μmol·L-1的正义引物QA2F0.5μL、10μmol·L-1的反义引物QA2R...

【专利技术属性】
技术研发人员：任芳，董雅凤，张尊平，范旭东，胡国君，张梦妍，
申请(专利权)人：中国农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21