一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(Adenine base editor,ABE)脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。所述腺嘌呤单碱基编辑系统由TadA:TadA*:Cas9的融合基因和gRNA两部分组分组成。其能催化靶位点处腺嘌呤(Adenine,A)至鸟嘌呤(Guanine，G)的高效置换，在人类疾病基因编辑治疗和疾病模型构建中有广泛的应用前景。为此，我们开发了首个能够检测ABE系统全基因组范围内脱靶效应的检测方法——EndoV‑seq。本发明专利技术提供的EndoV‑seq方法在基因编辑，尤其是基因编辑治疗领域，具有广泛的应用前景。

A method for detecting miss-target effect of adenine single base editing system based on whole genome sequencing and its application in gene editing

The invention provides a method for detecting the miss-target effect of an Adenine base editor (ABE) system based on genome-wide sequencing and its application in gene editing. The adenine single base editing system is composed of two components: TadA: TadA*: Cas9 fusion gene and gRNA. It can catalyze the efficient substitution of adenine (A) to guanine (G) at the target site, and has broad application prospects in human disease gene editing therapy and disease model construction. To this end, we have developed the first method to detect the whole genome Miss effect of ABE system, EndoV_seq. The EndoV SEQ method provided by the invention has wide application prospects in the field of gene editing, especially in the field of gene editing therapy.

【技术实现步骤摘要】
一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用
本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及是基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(Adeninebaseeditor,ABE)脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统是一项新的人工核酸酶技术，其是由gRNA(guideRNA)和Cas9蛋白组成的复合物。在靶位点3’末端PAM(Protospaceradjacentmotif)序列的帮助下，该gRNA-Cas9蛋白复合物通过gRNA5’末端的20个碱基与靶DNA结合，从而将内切核酸酶Cas9招募到靶位点处，切割靶DNA，从而编辑靶基因。虽然，CRISPR/Cas9技术的出现，极大地提高了基因定点突变的效率，但目前依然无法满足临床基因治疗的需要。最近，基于CRISPR/Cas9技术，科学家开发了新一代的基因编辑系统——腺嘌呤单碱基编辑系统(Adeninebaseeditor,ABE)。ABE系统是由TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和gRNA两部分组分组成的。在gRNA的引导下，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白能够与DNA上的靶位点结合，其中与gRNA互补的DNA链会被Cas9核酸酶切断，而非互补链上4-9位的A碱基则会被腺嘌呤脱氨酶——TadA蛋白——催化脱氨基形成I碱基。随着DNA的复制，I(次黄嘌呤，Inosine)碱基会被G(鸟嘌呤,Guanine)碱基替代，从而实现A至G的碱基置换。与CRISPR/Cas9核酸酶相比，ABE系统的效率更高。由于,ABE系统能在不诱导DNA双链断裂的情况下实现A至G的碱基置换，其安全性比CRISPR/Cas9核酸酶也更高。大约48％的人致病单碱基突变可以通过A至G的碱基置换实现修复，从而最终实现遗传疾病的治疗，所以ABE系统在人类疾病基因治疗领域有着广泛的应用前景。但是，目前仍未有一项能够在全基因组范围内检测ABE系统脱靶效应的方法，这严重制约了ABE系统的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述ABE系统尚无全基因组范围内检测脱靶效应的方法，提供一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。在本专利技术一具体实施例中，本专利技术通过基因合成、分子克隆、蛋白表达纯化、体外转录、核酸纯化、全基因组测序、PCR产物深度测序、生物信息学分析等技术检测ABE系统的脱靶效应。同时，我们还结合细胞转染和PCR产物深度测序技术对该检测方法的有效性和灵敏度进行了验证。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：第一方面，本专利技术提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、将TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、一种或多种靶向待测DNA序列的gRNA以及基因组DNA共混后进行反应；其中，所述基因组DNA包含有待测DNA序列,在所述反应体系中，TadA:TadA*:Cas9和gRNA复合物切割与gRNA互补的待测DNA链，同时将非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤；(2)、在步骤(1)反应后的体系中加入内切核酸酶V切割包含次黄嘌呤DNA,造成DNA双链断裂；(3)、利用全基因组测序以及生物信息学分析检测腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶效应。在本专利技术第一方面一具体实施例中，本专利技术提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(EndoV-seq)；所述EndoV-seq首先利用体外纯化的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白与gRNA共处理基因组DNA；TadA:TadA*:Cas9和gRNA的复合物将切割与gRNA互补的DNA链，同时将非互补链上的A转变成I；然后，利用内切核酸酶V(EndonucleaseV，EnodV)切割包含I碱基的基因组DNA,造成DNA双链断裂；最后，利用全基因组测序结合生物信息学分析检测DNA双链断裂，从而探究ABE系统的脱靶效应。我们将这一方法命名为EndoV-seq。在本专利技术第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、腺苷脱氨酶结构域。在本专利技术第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、连接多肽、腺苷脱氨酶结构域。本领域技术人员可以理解的是，本专利技术所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白由Cas9效应蛋白与腺苷脱氨酶(简称TadA蛋白)融合而成，本领域技术人员可以根据需要，利用一条或多条连接多肽，将一个Cas9效应蛋白结构域与一个或多个TadA蛋白进行连接，获得融合蛋白，在本专利技术一具体实施例中，所述TadA蛋白均重复一次。可以理解的是，所述Cas9效应蛋白和TadA蛋白的N端和C端的连接顺序为本领域常规技术，连接多肽包括但不限于本领域常规的连接多肽片段，常见地，比如GSlinker。本领域技术人员可以理解的是，本领域技术人员可以根据具体需要，针对基因组DNA设计任意特异性靶向的gRNA，并对gRNA进行本领域熟知的修饰，以提高gRNA靶向特异性。在本专利技术一具体实施例中，本专利技术设计的gRNA序列包括：HBG：GTGGGGAAGGGGCCCCCAAGAGG，其中下划线标注的为PAM序列VEGFA3：GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGG，其中下划线标注的为PAM序列。本领域技术人员可以理解的是，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白中，TadA为腺苷脱氨酶的缩写，TadA*为TadA突变体的缩写，Cas9为CRISPR/Cas系统的Cas9效应蛋白。进一步地，所述CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域中，所述Cas9效应蛋白包括但不限定于无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白StreptococcuspyogenesCas9(SpCas9),StaphylococcusaureusCas9(SaCas9),LachnospiraceaeCpf1(LbCpf1),AcidaminococcusCpf1(AsCpf1),StreptococcusthermophilusCas9(StCas9),andNeisseriameningitidisCas9(NmCas9)和FrancisellaCpf1(FnCpf1)等。进一步地，所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白中，腺苷脱氨酶TadA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示或为与SEQIDNO.2所示氨基酸至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％一致的序列。在本专利技术第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的制备方法是将合成的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白原核表达载体(pET42b-ABE7.10，SEQIDNO.3)载体在大肠杆菌中进行表达并纯化TadA:TadA*:Cas9融合蛋白。更具体地，该制备过程包括步骤(1)将pET42b-ABE7.10转化到BL21StarTM(DE3)E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、将TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、一种或多种靶向待测DNA序列的gRNA以及基因组DNA共混后进行反应；其中，所述基因组DNA包含有待测DNA序列,在所述反应体系中，TadA:TadA*:Cas9和gRNA复合物切割与gRNA互补的待测DNA链，同时将非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤；(2)、在步骤(1)反应后的体系中加入内切核酸酶V切割包含次黄嘌呤的DNA,造成DNA双链断裂；(3)、利用全基因组测序以及生物信息学分析检测腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶效应。

【技术特征摘要】
1.一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、将TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、一种或多种靶向待测DNA序列的gRNA以及基因组DNA共混后进行反应；其中，所述基因组DNA包含有待测DNA序列,在所述反应体系中，TadA:TadA*:Cas9和gRNA复合物切割与gRNA互补的待测DNA链，同时将非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤；(2)、在步骤(1)反应后的体系中加入内切核酸酶V切割包含次黄嘌呤的DNA,造成DNA双链断裂；(3)、利用全基因组测序以及生物信息学分析检测腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶效应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、腺苷脱氨酶结构域。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、连接多肽、腺苷脱氨酶结构域。4.根据权利要求1-3任一权利要求所述制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域中，所述Cas9效应蛋白包括但不限定于无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白，所述无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白包括StreptococcuspyogenesCas9(SpCas9),StaphylococcusaureusCas9(SaCas9),LachnospiraceaeCpf1(LbCpf1),Acidam...

【专利技术属性】
技术研发人员：松阳洲，梁普平，黄军就，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44