本发明专利技术公开了一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒。本发明专利技术以EGFR基因L858R突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测EGFR基因L858R突变，而且检测突变的能力高达0.1％，能够有效检测患者游离DNA中L858R突变，对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
A Kit for Detecting L858R Mutation Locus of EGFR Gene by Digital PCR
The invention discloses a digital PCR detection kit for the mutation site of EGFR gene L858R. The method takes the L858R mutation of EGFR gene as the detection object, through the optimized combination of specific primers and fluorescent probe, so as to achieve accurate, simple and rapid simultaneous detection of L858R mutation of EGFR gene, and the detection ability of mutation is as high as 0.1%. The method can effectively detect L858R mutation in patients'free DNA, and the short fragment DNA obtained from formaldehyde fixed paraffin-embedded samples is still available. It has the same amplification and detection ability as the DNA of fresh tissue samples.
【技术实现步骤摘要】
一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒
本专利技术属于分子诊断
，具体涉及一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒。
技术介绍
近年来，非小细胞肺癌(NSCLC)治疗领域里程碑式的改变是针对表皮生长因子受体(EGFR)基因突变阳性的晚期患者采用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)进行治疗。治疗获益的患者表现为无疾病进展期(PFS)延长，客观反应率(ORR)提高，生活质量得到极大改善。尽管对初始EGFR-TKI治疗应答良好，但大部分患者在平均治疗10个月后会出现对此类药物的耐药。外显子21突变占我国非小细胞肺癌上皮生长因子受体基因突变总数的40.3％，其中94.4％的突变为第858为密码子发生碱基替换(T-G)突变，使得EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸(L)转变为精氨酸(R)，简称L858R。因此，临床上通过检测非小细胞肺癌患者外周血中游离DNA中是否存在L858R突变，来判断患者服用何种EGFR-TKI更易获得疗效。但往往患者游离DNA中L858R突变含量极低，对于检测方法学的敏感度要求极高，常规的检测方法无法很好的满足该需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒。本专利技术通过使利用特异性引物和探针在特定的数字PCR反应体系，将反应体系分成近2万个油包水滴，对目标突变核酸序列扩增，通过一条与扩增产物序列能够互补的荧光探针，在目标突变核酸序列扩增过程中荧光探针被DNA聚合酶水解将荧光基团释放出来，从而计算具有荧光信号的反应油包水滴数，来判断突变情况。本专利技术的技术方案如下：一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒，包括检测引物对和荧光探针组，检测引物对包括分别如SEQIDNO01和02所示的正向引物和反向引物，荧光探针组包括分别如SEQIDNO03和04所示的第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针和第二荧光探针的5’端分别标记有彼此不同的第一荧光基团和第二荧光基团，3’端标记有与上述第一和第二荧光基团相互焠灭的第三荧光基团，且第一荧光探针和第二荧光探针彼此不相同的碱基具有LNA标记，其反应体系如下：在本专利技术的一个优选实施方案中，所述第一荧光基团为FAM。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述第二荧光基团为HEX。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述第三荧光基团为BHQ。进一步优选的，所述反应体系为：本专利技术的有益效果是：本专利技术以EGFR基因L858R突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测EGFR基因L858R突变，而且检测突变的能力高达0.1％，能够有效检测患者游离DNA中L858R突变，对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。附图说明图1为本专利技术实施例1中数字PCR检测EGFR基因L858R突变阴性的样品检测图。图2为本专利技术实施例1中数字PCR检测EGFR基因L858R突变阳性的样品检测图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1突变标准品是通过以下方式制备的：将已知突变的EGFR基因L858R突变型细胞系基因组DNA和野生型细胞系基因组DNA按照不同比例混合后再加到Covariis超声管中并进行超声处理，获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。野生型标准品是通过以下方式获得的：将已知突变的EGFR基因L858R突变型细胞系基因组DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理，获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。按照上述方法获得的突变比例分别为10％、5％和0.1％的标准品。建立数字PCR检测EGFR基因L858R突变的反应体系，此方法主要包括以下步骤：(1)根据Cosmic数据公布的EGFR基因L858R突变和EGFR基因的野生型DNA基因序列和突变基因序列，设计检测引物对和荧光探针组，检测引物对包括分别如SEQIDNO01和02所示的正向引物和反向引物，荧光探针组包括分别如SEQIDNO03和04所示的第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针的5’端标记有FAM，第二荧光探针的5’端标记有HEX，第一荧光探针和第二荧光探针的3’端均标记有BHQ，且第一荧光探针和第二荧光探针彼此不相同的碱基具有LNA标记，具体为如下第一荧光探针L858R-M-P-FAM和第二荧光探针L858R-WT-P-HEX中的大写加粗字体的碱基具有LNA标记：L858R-M-P-FAM：agtttggccCgcccaagctgggL858R-WT-P-HEX：agtttggccAgcccaagctggg。(2)数字PCR扩增反应体系配制并上机检测。(3)检测荧光信号，以有荧光信号的微滴孔数作为结果判断的标准。步骤(1)中根据Cosmic数据公布的EGFR基因L858R野生型基因序列和突变突变基因序列，设计高特异性修饰引物和特异性荧光探针，详见下表。步骤(2)的数字PCR扩增反应体系为：序号物料物料浓度用量(μL)110×PCR缓冲液10×52MgCl225mM43dNTPs10mM64L858R-F(SEQIDNO01)50μM25L858R-R(SEQIDNO02)50mM26L858R-M-P-FAM(SEQIDNO03)50mM27L858R-WT-P-HEX(SEQIDNO04)50mM28Taq酶5U19H2O纯化水2110DNA模板2ng/ul511总体积50以上试剂组分：10×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自赛默飞公司。所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性10分钟，1个循环；94℃变性30秒，60℃退火/延伸1分钟，40个循环；98℃退酶活10分钟，4℃保存。步骤(3)检测FAM和HEX荧光信号，是采用Bio-radQX-200数字PCR扩增仪(反应体系处理参照https://wenku.baidu.com/view/81cbe361e41R964bcf84b9d528ea81c758f52e07.html)。一次可检测96份样品(包括阴阳性对照)。根据荧光PCR扩增仪显示的阳性孔数判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM信号孔数达到设定的阈值线以上的作为阴阳性判断的标准，突变比例是FAM信号孔数/(FAM信号孔数+HEX信号孔数)。图1为本专利技术数字PCR检测EGFR基因L858R突变阴性的样品检测图；图2为本专利技术数字PCR检测EGFR基因L858R突变阳性的样品检测图。实施例2一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒，包括检测引物对和荧光探针组，检测引物对包括分别如SEQIDNO01和02所示的正向引物和反向引物，荧光探针组包括分别如SEQIDNO03和04所示的第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针和第二荧光探针的5’端分别标记有彼此不同的第一荧光基团和第二荧光基团，3’端标记有与上述第一和第二荧光基团相互焠灭的第三荧光基团，且第一荧光探针本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：包括检测引物对和荧光探针组，检测引物对包括分别如SEQ ID NO 01和02所示的正向引物和反向引物，荧光探针组包括分别如SEQ ID NO 03和04所示的第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针和第二荧光探针的5’端分别标记有彼此不同的第一荧光基团和第二荧光基团，3’端标记有与上述第一和第二荧光基团相互焠灭的第三荧光基团，且第一荧光探针和第二荧光探针彼此不相同的碱基具有LNA标记，其反应体系如下：
【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因L858R突变位点的数字PCR检测试剂盒，其特征在于：包括检测引物对和荧光探针组，检测引物对包括分别如SEQIDNO01和02所示的正向引物和反向引物，荧光探针组包括分别如SEQIDNO03和04所示的第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针和第二荧光探针的5’端分别标记有彼此不同的第一荧光基团和第二荧光基团，3’端标记有与上述第一和第二荧光基团相互焠灭的第三荧光基团，且第一荧光...
【专利技术属性】
技术研发人员：甘煌灿，康灿昆，陈琰，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。