腺病毒载体系统及重组腺病毒构建方法技术方案

提供一套腺病毒载体系统及重组腺病毒构建方法。载体系统包括腺病毒质粒pKAd5f11p‑EF1aP和pKAd5f11pES‑PmeI，以及穿梭质粒pUC19‑PM。腺病毒质粒含有E1/E3缺失的人5型腺病毒(HAdV‑5)基因组，并且原HAdV‑5fiber基因由HAdV‑5和HAdV‑11p的融合基因F5‑11p替代；含有的PmeI位点为外源基因插入部位。pKAd5f11p‑EF1aP质粒在原E1区添加人EF1a启动子。穿梭质粒pUC19‑PM与pKAd5f11pES‑PmeI质粒配套使用。重组腺病毒构建方法包括：PCR扩增获得两侧含有同源重叠区的目的基因片段，与PmeI线性化的腺病毒质粒进行DNA组装，得到含有外源目的基因的腺病毒质粒；或者先将多个基因片段克隆到穿梭质粒，再使用限制性内切酶切下含全部目的基因的片段，与PmeI线性化的pKAd5f11pES‑PmeI进行DNA组装，获得含有外源目的基因的腺病毒质粒。

Adenovirus vector system and construction of recombinant adenovirus

To provide an adenovirus vector system and a method for constructing recombinant adenovirus. Vector systems include adenovirus plasmids pKAd5f11p EF1aP and pKAd5f11pES PmeI, and shuttle plasmids pUC19 PM. The adenovirus plasmid contains the genome of human adenovirus type 5 (HAdV 5) deleted in E1/E3, and the original HAdV 5fiber gene is replaced by the fusion gene F5 11p of HAdV 5 and HAdV 11p, and the site containing PMI is the insertion site of exogenous gene. The plasmid pKAd5f11p EF1aP added human EF1a promoter to the original E1 region. Shuttle plasmid pUC19 PM was used in conjunction with pKAd5f11pES PmeI plasmid. The construction methods of recombinant adenovirus include: obtaining target gene fragments containing homologous overlapping regions on both sides by PCR amplification, DNA assembly with PmeI linearized adenovirus plasmid, and obtaining adenovirus plasmid containing exogenous target genes; or cloning multiple gene fragments into shuttle plasmid, then cutting all target gene fragments with restriction endonuclease, and linearizing pK5 Ad5 with PmeI. Adenovirus plasmids containing exogenous target genes were obtained by DNA assembly with f11pES PmeI.

【技术实现步骤摘要】
腺病毒载体系统及重组腺病毒构建方法
本专利技术属于基因治疗领域，具体而言，本专利技术涉及一套腺病毒载体系统及重组腺病毒构建方法。
技术介绍
腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒，目前腺病毒科分为5个属[1]，有多种型别的腺病毒已经被开发为基因转移载体，在基础科研、基因治疗和载体疫苗领域得到广泛应用[2-4]。腺病毒的基因组长约26-46kb，这使得腺病毒载体的构建与常见质粒载体(一般长度小于10kb)不同。太长的基因组使得在腺病毒载体上富集一个多克隆位点非常困难。针对重组腺病毒的构建，开发了多种方法[5-7]。腺病毒载体的构建经历了体外直接连接、包装细胞内重组、细菌内重组、位点特异性重组4个发展阶段，同时随着分子生物学技术的发展，改进的体外连接法又得到应用[5-7]。(1)体外连接法。这种方法需要全长腺病毒基因组和一个含腺病毒基因组左末端序列的质粒，包括左端反向末端重复(Invertedterminalrepeat,ITR)、包装信号和E1A的增强子序列。将目的基因克隆到质粒的病毒序列下游，ClaI酶切获得含目的基因的基因组左末端，连接到ClaI酶解的野生型腺病毒基因组(ClaI在病毒基因组仅有一个酶切位点，位于E1A基因内部)，将得到的含目的基因的的基因组DNA直接转染包装细胞293，产生重组病毒颗粒。这种方法需要培养野生型腺病毒以提取病毒基因组，能够使用的酶切位点仅有一个，连接效率低，而且仅删除了部分E1A基因，外源基因载量有限，所以现已淘汰不用。(2)真核细胞同源重组法。1994年，GrahamF建立了在293细胞同源重组产生重组腺病毒的方法。这个方法需要2个质粒：骨架质粒含有腺病毒绝大部分基因组序列，但不含有包装信号；穿梭质粒含有ITR、包装信号和目的基因克隆位点，以及两段与骨架质粒有重叠的序列。将目的基因克隆到穿梭质粒，与骨架质粒共转染293细胞，由于这两个质粒的部分序列有重叠，能够在细胞内发生同源重组，最终产生完整的载体基因组，并包装出重组病毒颗粒。该方法曾经被广泛使用，推动了腺病毒载体的发展。由于细胞内重组效率低，某些重组事件还可能产生可复制病毒(RCV)，必需经过噬斑纯化才能获得正确的克隆化的重组病毒，费时费力，正逐渐被其他方法替代。(3)细菌内同源重组法。这种方法使用的骨架质粒和穿梭质粒与细胞内重组法相似，目的基因克隆到穿梭质粒后，与骨架质粒共转化细菌细胞(如大肠杆菌BJ5183菌株)，这种菌种细胞内重组酶阳性，两质粒在细菌内发生重组，通过抗生素筛选得到重组质粒(含有腺病毒载体基因组)，扩增纯化后转染包装细胞，拯救出重组病毒颗粒。这种方法的代表是目前广泛使用的AdEasy系统(美国stratagene公司)。由于细菌细胞内重组得到克隆化的腺病毒质粒，在包装细胞内拯救获得的是均一的种子病毒，无需进行耗时的噬斑纯化，可以直接用于重组病毒扩增。但细菌内重组效率较低，存在一些假阳性克隆，重组酶阳性细菌一般不能用于腺病毒质粒的大量扩增，获得的阳性腺病毒质粒克隆需要转化新的细菌细胞，以制备足量质粒用于病毒拯救；另外，带有重复序列或复杂高级结构的质粒在重组酶阳性细菌复制时，质粒基因组不稳定，可能发生部分序列丢失，产生变异的腺病毒质粒，造成无法拯救或拯救出错误的重组病毒。(4)位点特异性重组法。这类方法使用来源于噬菌体的重组酶，这类重组酶能够识别特异性序列位点(长度数十碱基对至数百碱基对)并引发含有该位点的序列之间的重组；在腺病毒骨架和穿梭质粒中添加重组酶能够识别的特异性位点，在细胞内表达对应的噬菌体重组酶或体外使用重组酶，介导骨架质粒和穿梭质粒之间的位点特异性重组，将目的基因引入骨架质粒，形成带有重组腺病毒基因组的腺病毒质粒；转染包装细胞，进行病毒载体拯救[6,8]。该方法进一步简化了腺病毒质粒的制备过程，它的缺限是在腺病毒基因组的某些部位不可避免的残留了重组酶特异性识别位点。(5)利用归位内切酶(HomingEndonuclease)的直接连接法。归位内切酶识别的序列长度大于20bp，其中特异性序列至少9～11bp，这意味着这类内切酶的识别切割的序列非常少见，在长36kb的野生型腺病毒基因组中没有该酶的切割位点。这种方法也使用类似骨架质粒和穿梭质粒的2个质粒，但2者间不需要有序列重叠，目的基因克隆到穿梭质粒上，使用归位内切酶切割后连接到骨架质粒形成完整载体基因组，转染包装细胞，拯救出重组病毒。美国Clontech公司的Adeno-X系统采用该方法。另外，Clontech公司近年来开发了Adeno-X系统3，这个系统将带有目的基因的PCR产物利用In-Fusion技术直接插入到该公司提供的已经线性化pAdenoX载体中，即获得腺病毒质粒。该方法需要购买线性化的pAdenoX载体，外源基因插入位点和重组病毒基因组其他部分已经确定，不能用于重组腺病毒的人工改造。目前已有的腺病毒载体系统均存在缺陷，有些构建步骤繁琐，耗时较长，有些在重组病毒中引入了不必要的外源序列，有些不能用于重组腺病毒的反向遗传改造。近年来，新的生物特性不同的腺病毒不断被发现，因此，本领域对构建过程更加快捷简便的、人工改造更加方便灵活的腺病毒载体系统和重组病毒构建方法存在需求。
技术实现思路
为了满足本领域的需求，本专利技术的目的是提供新的腺病毒载体系统和重组病毒构建方法。本专利技术人通过在腺病毒载体基因组引入单一酶切位点，借助DNA组装技术，建立了在腺病毒载体基因组直接无缝插入外源目的基因的载体系统和重组腺病毒构建方法。在第一方面，本专利技术提供一套腺病毒载体系统，包括两个腺病毒质粒和一个穿梭质粒。其中，腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP由本专利技术人设计并构建得到(实施例1-实施例4)。本专利技术人利用前期构建的pAdeasyf11p腺病毒骨架质粒(含有改造的fiber基因)[9]、pAd5GXP腺病毒质粒(消除了HAdV-5基因组内部原有的PmeI限制性内切酶位点)[10]，构建了腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP。pKAd5f11p-EF1aP质粒含有E1/E3区缺失的HAdV-5基因组，原HAdV-5fiber基因由HAdV-5、HAdV-11p的融合fiber基因(F5-11p)替代，基因组内部原有的PmeI限制性内切酶位点被消除；在原E1区位置添加有人EF1a启动子和SV40polyA加尾信号，并且在EF1a启动子和SV40polyA加尾信号之间添加单一的PmeI酶切位点(全质粒唯一的PmeI位点)；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因。融合基因F5-11p由HAdV-5fiber的tail结构域与HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域编码区构成。能够利用后述的DNA组装方法直接在pKAd5f11p-EF1aP的PmeI位点引入外源目的基因，拯救重组病毒。腺病毒通过表达在病毒颗粒五邻体的fiber识别、结合细胞受体，进而感染靶细胞，HAdV-5的fiber蛋白结合细胞的受体是CAR分子，HAdV-11p的fiber识别结合的细胞受体是DSG2或CD46分子[11,12]。由腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP出发构建的重组病毒将带有融合的fiber蛋白，从而具有HAd本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一套腺病毒载体系统，其包括两个腺病毒质粒和一个穿梭质粒，其中所述的两个腺病毒质粒分别命名为pKAd5f11p‑EF1aP和pKAd5f11pES‑PmeI，并且所述穿梭质粒命名为pUC19‑PM。

【技术特征摘要】
1.一套腺病毒载体系统，其包括两个腺病毒质粒和一个穿梭质粒，其中所述的两个腺病毒质粒分别命名为pKAd5f11p-EF1aP和pKAd5f11pES-PmeI，并且所述穿梭质粒命名为pUC19-PM。2.根据权利要求1所述的两个腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP和pKAd5f11pES-PmeI，其特征在于：含有E1/E3缺失的人5型腺病毒(HAdV-5)基因组；HAdV-5基因组原HAdV-5fiber基因由HAdV-5、HAdV-11pfiber的融合基因(F5-11p)替代；HAdV-5基因组原有PmeI位点被突变去除；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因。3.根据权利要求1和2所述的两个腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP和pKAd5f11pES-PmeI，其特征在于：含有的融合fiber基因(F5-11p)由HAdV-5fiber的tail结构域与HAdV-11pfiber的shaft和knob结构域编码区融合得到。4.根据权利要求1、2和3所述的腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP，其特征在于：在原E1区位置添加有人EF1a启动子和SV40polyA加尾信号；并且在EF1a启动子和SV40polyA加尾信号之间含有一个单一限制性内切酶PmeI酶切位点。5.根据权利要求1、2和3所述的腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI，其特征在于：在原E1区位置添加有一个单一的限制性内切酶PmeI酶切位点。6.根据权利要求1所述的穿梭质粒pUC19-PM，其特征在于：含有一个多克隆位点，由限制性内切酶EcoRI，SacI，KpnI，SmaI，BamHI，XbaI，EcoRV，SalI，PstI，SphI，HindIII，ClaI和EcoRV酶切位点依次组成；多克隆位点上游和下游分别含有一段与pKAd5f11pES-PmeI质粒的PmeI位...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红岩，鲁茁壮，洪涛，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11