一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及其应用。通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱变青鳉单倍体胚胎干细胞(HX1细胞)，进而筛选得到抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1。所述抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1于2018年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201832。为进一步鉴定参与病毒感染的宿主因子提供了实验和理论基础，并为抗病毒鱼的遗传育种提供了新途径。

Preparation and application of haploid embryonic stem cells against red grouper nerve necrosis virus

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a preparation method and application of haploid embryonic stem cells against red grouper nerve necrosis virus blue gill. Haploid embryonic stem cells (HX1 cells) were mutagenized by ethyl nitrosourea (ENU), and then haploid embryonic stem cells G1 was screened for anti-red grouper neuronecrosis virus. The anti-red grouper neuronecrosis virus haploid embryonic stem cell G1 was deposited in the China Typical Culture Preservation Center on January 17, 2018 at Wuhan University, Wuhan, China, with the storage number CCTCC NO: C201832. It provides experimental and theoretical basis for further identification of host factors involved in virus infection, and provides a new way for genetic breeding of antiviral fish.

【技术实现步骤摘要】
一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗鱼类神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
单倍体细胞只具有一套染色体，没有等位基因的存在，细胞中每个基因均只有一个，且每个基因均能发挥自己的作用，因此单倍体细胞是研究基因功能的良好材料。目前单倍体细胞已经在基因筛选鉴定、病原学、动物育种和转基因动物等方面得到广泛的应用。例如，通过对人类单倍体细胞进行深度基因插入突变，成功鉴定粘多糖与裂谷热病毒感染密切相关。通过对人类单倍体细胞进行全基因组功能缺失筛选实验，成功鉴定一系列与汉坦病毒膜融合相关的宿主因子。单倍体胚胎干细胞(HaESC)同时具有单倍体细胞和胚胎干细胞的特性，因此更是研究基因功能的理想模型，具有巨大的应用潜力。目前，多个物种的HaESC已被成功建立，包括青鳉、猴、大鼠和人等。HaESC的最大优势是可以大范围筛选隐性基因，在正反向遗传学的研究中起到了重要作用，一方面可以通过基因打靶、CRISPR-Cas9技术等方式敲除或敲入基因，让部分基因功能缺失，通过表型改变来研究目的基因的功能和作用。另一方面，通过化学诱导对基因组进行大规模突变，快速地建立涵盖整个基因组的基因突变细胞库，形成可遗传的突变表型，进而深度挖掘该表型对应的基因，最终揭示该表型的形成机制。乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程，而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团，从而引起碱基配对错误。利用ENU可在较短时间内诱导生物体产生大量随机突变表型，筛选获得具有特殊表型的动物或细胞模型后，可以定位克隆突变基因，联系表型特征进而推测相应基因的功能。目前ENU已被广泛应用于基因功能的研究。鱼类神经坏死病毒是一种单股正链RNA病毒，隶属于诺达病毒科(Nodaviridae)家族。该病毒引发的鱼类神经坏死病是一种世界范围内流行的鱼类传染性疾病，至今已有120多种鱼类被该病毒感染，被感染鱼类的死亡率高达50-100％，对世界水产养殖业造成巨大经济损失。然而，目前对该病毒的致病机制尚不清楚，特别是与该病毒感染直接相关的宿主基因尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，通过ENU诱变青鳉单倍体胚胎干细胞(HX1细胞)，进而筛选得到抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞G1。本专利技术的另一目的是提供抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞G1在抗病毒鱼的遗传育种领域的应用。本专利技术的技术方案为：一种抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)青鳉单倍体胚胎干细胞传代培养：将HX1细胞在ESM4培养基中培养，加入蛋白补充剂，细胞用胰蛋白酶消化后传至铺有明胶的6孔细胞培养板，放置于28℃培养箱中培养24h；(2)ENU诱变：在培养基中加入浓度为10uM的O6-BG预处理24h，然后去掉培养基，更换为ENU终浓度为10mg/ml的ESM4培养基，继续培养48h，将诱变后的HX1细胞接种于24孔细胞培养板，每孔3×104细胞，置于28℃培养箱培养24h；(3)RGNNV感染：去掉培养基，加入含有RGNNV的ESM4培养基，将存活的ENU诱变HX1细胞(EHX1细胞)继续传代，EHX1细胞经连续传代稳定生长后，经胰蛋白酶消化后重悬于ESM4培养基，取重悬液接种于直径为10cm的培养皿中，放置于28℃培养箱继续培养，每隔3天更换一半的培养基；(4)制备抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞：待克隆样细胞生长至直径为200μm时，在体式显微镜下挑取克隆样细胞，并接种于提前铺有明胶的96孔细胞培养板中，待96孔细胞培养板中细胞长至密度为90％-100％时，继续先后传代至48孔细胞培养板，12孔细胞培养板和6孔细胞培养板，最终传至10cm培养皿，成功获得50个单克隆HX1细胞系，选择生长状态良好的G1细胞系。优选地，步骤(1)中所述蛋白补充剂为青鳉胚胎提取物(MEE)，鱼血清和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。优选地，步骤(1)中所述胰蛋白酶质量分数为0.25％。优选地，步骤(1)中所述6孔板中细胞含量为105个细胞/孔。优选地，步骤(2)中所述ENU浓度为10mg/ml。优选地，步骤(3)中所述ESM4培养基中RGNNV含量为MOI＝5。优选地，步骤(3)中所述重悬液接种密度为104个细胞/皿。上述抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞于2018年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：C201832；保藏培养物名称为：抗鱼类神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1。上述抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞系在抗病毒鱼的遗传育种领域的应用。本专利技术的有益效果如下：本专利技术通过ENU诱变HX1细胞，进而筛选得到抗RGNNV的青鳉单倍体胚胎干细胞G1，并对其细胞单倍性及生长特性，多能性以及病毒抗性进行研究。结果表明，G1细胞为单倍体细胞；在28℃培养条件下，G1细胞在含15％胎牛血清的ESM4培养基中生长速率最快；G1细胞能够在体外形成拟胚体，且多能性相关基因在G1细胞大量表达。在RGNNV感染后，G1细胞具有抗RGNNV特性，能够抑制RGNNV的入侵，并且G1细胞对RGNNV具有清除作用。综上所述，通过ENU诱导及RGNNV感染，成功获得具有抗RGNNV特性的青鳉单倍体胚胎干细胞G1，这为进一步鉴定参与病毒感染的宿主因子提供了实验和理论基础，并为抗病毒鱼的遗传育种提供了新途径。附图说明附图1为G1细胞中染色体数目分布图；附图2为G1细胞、青鳉精巢细胞和肝细胞的细胞流式周期分析图；附图3为G1细胞在不同浓度胎牛血清下的生长曲线图；附图4为G1细胞在不同温度下的生长曲线图；附图5A为G1细胞碱性磷酸酶染色图片，附图5B为青鳉肝细胞碱性磷酸酶染色图片，附图5C为青鳉脑细胞碱性磷酸酶染色图片；附图6A为G1细胞形成拟胚体图片，附图6B为G1细胞拟胚体分化为神经细胞的图片，附图6C为G1细胞拟胚体分化为肌肉细胞的图片；附图7为G1细胞和HX1细胞中多能性基因的表达情况对比图；附图8为G1细胞和拟胚体中多能性基因和内中外胚层标记基因的表达情况对比图；附图9为G1细胞拟胚体分化后细胞中神经和肌肉标记基因表达情况图；附图10A、10B、10C、10D分别为HX1细胞对照组及感染RGNNV后0h、24h、48h和72h的图片，附图10E、10F、10G、10H分别为G1细胞对照组及感染RGNNV后0h、24h、48h和72h的图片；附图11为HX1细胞和G1细胞在感染RGNNV后第24h，48h和72h时RDRP基因表达情况图，其中*表示差异达到显著水平(P＜0.05)，**差异达到极显著水平(P＜0.01)；附图12为HX1细胞和G1细胞在感染RGNNV后第2h和4h时的RDRP基因表达情况图，其中*表示差异达到显著水平(P＜0.05)，**差异达到极显著水平(P＜0.01)；附图13为RGNNV感染G1细胞后，细胞连续传代，第1至15代G1细胞中RDRP基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)青鳉单倍体胚胎干细胞传代培养：将青鳉单倍体胚胎干细胞在ESM4培养基中培养，加入蛋白补充剂，细胞用胰蛋白酶消化后传至铺有明胶的6孔细胞培养板，放置于28℃培养箱中培养24h；(2)乙烷基亚硝基脲诱变：在培养基中加入浓度为10μM的O6‑BG预处理24h，然后去掉培养基，更换为乙烷基亚硝基脲终浓度为10mg/ml的ESM4培养基，继续培养48h，将诱变后的青鳉单倍体胚胎干细胞接种于24孔细胞培养板，每孔3×104细胞，置于28℃培养箱培养24h；(3)赤点石斑鱼神经坏死病毒感染：去掉培养基，加入含有赤点石斑鱼神经坏死病毒的ESM4培养基，将存活的乙烷基亚硝基脲诱变的青鳉单倍体胚胎干细胞继续传代，细胞经连续传代稳定生长后，经胰蛋白酶消化后重悬于ESM4培养基，取重悬液接种于直径为10cm的培养皿中，放置于28℃培养箱继续培养，每隔3天更换一半的培养基；(4)制备抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞：待克隆样细胞生长至直径为200μm时，在体式显微镜下挑取克隆样细胞，并接种于提前铺有明胶的96孔细胞培养板中，待96孔细胞培养板中细胞长至密度为90％‑100％时，继续先后传代至48孔细胞培养板，12孔细胞培养板和6孔细胞培养板，最终传至10cm培养皿，成功获得50个单克隆青鳉单倍体胚胎干细胞系，选择生长状态良好的G1细胞系。...

【技术特征摘要】
1.一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)青鳉单倍体胚胎干细胞传代培养：将青鳉单倍体胚胎干细胞在ESM4培养基中培养，加入蛋白补充剂，细胞用胰蛋白酶消化后传至铺有明胶的6孔细胞培养板，放置于28℃培养箱中培养24h；(2)乙烷基亚硝基脲诱变：在培养基中加入浓度为10μM的O6-BG预处理24h，然后去掉培养基，更换为乙烷基亚硝基脲终浓度为10mg/ml的ESM4培养基，继续培养48h，将诱变后的青鳉单倍体胚胎干细胞接种于24孔细胞培养板，每孔3×104细胞，置于28℃培养箱培养24h；(3)赤点石斑鱼神经坏死病毒感染：去掉培养基，加入含有赤点石斑鱼神经坏死病毒的ESM4培养基，将存活的乙烷基亚硝基脲诱变的青鳉单倍体胚胎干细胞继续传代，细胞经连续传代稳定生长后，经胰蛋白酶消化后重悬于ESM4培养基，取重悬液接种于直径为10cm的培养皿中，放置于28℃培养箱继续培养，每隔3天更换一半的培养基；(4)制备抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞：待克隆样细胞生长至直径为200μm时，在体式显微镜下挑取克隆样细胞，并接种于提前铺有明胶的96孔细胞培养板中，待96孔细胞培养板中细胞长至密度为90％-100％时，继续先后传代至48孔细胞培养板，12孔细胞培养板和6孔细胞培养板，最终传至10cm培养皿，成功获得50个单克隆青鳉单倍体胚胎干细胞系，选择生长状态良好的G1细胞系。2.根据权利要求1所述的一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾坤同，易梅生，张湾湾，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44