一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法技术

本发明专利技术公开了一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞系的复苏与传代培养。步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞接种鸭肝炎病毒，实现病毒大规模培养。步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的ELD50，在病毒ELD50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭肝炎病毒。本发明专利技术的全悬浮培养方法提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗生产的趋势，有广阔的应用前景及蕴含良好的经济效益。

A Full Suspension Culture Method for Duck Hepatitis Virus

The invention discloses a full suspension culture method of duck hepatitis virus, which comprises the following steps: step 1: recovery and subculture of passaged cell lines derived from duck embryo cells. Step 2: Duck hepatitis virus was inoculated into the passage cells derived from duck embryo cells in full suspension culture by second-order culture method to realize large-scale culture of duck hepatitis virus. Step 3: After exposure, ELD50 of duck hepatitis virus was detected every 12 hours. When ELD50 of duck hepatitis virus reached its peak, the virus was harvested and preserved, and the cultured duck hepatitis virus was obtained. The full suspension culture method of the invention improves the scale and efficiency of virus culture, conforms to the trend of vaccine production in the future, has broad application prospects and contains good economic benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法
本专利技术涉及一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种用传代细胞系全悬浮培养鸭肝炎病毒的方法，属于兽用生物制品

技术介绍
近年来，鸭病毒性肝炎在中国水禽养殖地区广泛流行，给养鸭业的健康发展造成严重威胁。鸭病毒性肝炎由鸭肝炎病毒(DHV)引起，主要引起3周龄以内的雏鸭发病，病死率可达100％。目前已报道的鸭肝炎病毒有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3个血清型。中国已发现Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒，其中流行的主要是Ⅰ型。目前尚无治该病的特效药物，接种鸭肝炎疫苗是预防和控制该病的最经济且行之有效的方法。在国内，鸭肝炎疫苗的生产主要还是依靠传统的鸡胚培养技术，通过在鸡胚中连续传代致弱，收集胚体，胚液等进行研磨，匀浆，收获病毒，制成疫苗。利用该方法虽然病毒滴度较高(108.3ELD50/mL)，但是因生产需要大量SPF鸡胚，不仅成本大，而且一旦爆发大规模禽流感，SPF鸡胚供应不足，就将导致疫苗生产的停滞，给养殖业带来巨大的风险。同时，鸡胚组织苗的生产，需要研磨匀浆，过滤纯化，不仅工序复杂，效率低下，而且操作过程中极易污染外源病毒，大大降低了疫苗的质量及安全性。同时，生产疫苗所产生的废物废料对环境造成污染，具有较大的生物安全风险。为了解决上诉鸡胚培养的缺点，许多专家学者进行了鸭肝炎病毒的细胞培养，以期缩短病毒培养周期，提高疫苗质量和抗原纯度。已报到的用于鸭肝炎病毒培养的细胞主要有鸡胚或鸭胚成纤维细胞，鸭胚肾细胞等原代细胞，但是因为原代细胞的制备实质上也是取鸡胚或鸭胚胚体进行制作，工序反而更加复杂，而且采用上述细胞进行鸭肝炎病毒的培养滴度大大降低，一般只能达到103.0-105.0ELD50/mL，无法达到生产要求，因无法突破这一瓶颈，因此利用细胞培养鸭肝炎病毒一直处于研究阶段，目前也没有细胞源鸭肝炎病毒疫苗上市的报道。随着无血清大规模培养技术的发展，采用传代细胞源悬浮培养病毒制备疫苗在生物医药行业的应用已经越来越广泛。规模化悬浮培养最大的优势在于通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。实现规模化悬浮培养的关键技术主要有4个，可适应病毒高效增殖的悬浮培养传代细胞，个性化培养基的研制，生物反应器的选择及培养工艺的选择及优化。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，目的在于提供用全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞培养鸭肝炎病毒的方法，从而为实现鸭肝炎病毒疫苗的大规模生产提供参考。本专利技术提供了一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养。步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞接种鸭肝炎病毒，实现病毒大规模培养。步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭肝炎病毒。进一步地，所述步骤2的二阶培养法操作方式如下，即全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸭肝炎病毒的接种，接毒完成后，将摇瓶放置于5％CO2培养箱中，在低转速下吸附0.5h-2h；吸附完成后补加病毒培养基，并放回到5％CO2培养箱中，调节合适转速，继续培养。进一步地，本专利技术的全悬浮培养方法还包括步骤4：取步骤2所得培养后的鸭肝炎病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用二阶培养法，将病毒接种至全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获鸭肝炎病毒为鸭胚细胞衍生的传代细胞传代细胞的适应毒。进一步地，步骤1所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞复苏与传代培养方法如下：从液氮中迅速取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入约20倍体积的细胞培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，使用细胞培养基将细胞吹打重悬均匀，细胞悬液接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养；每隔24h少量取样一次进行细胞计数，通过检查细胞密度和细胞活力等参数，监测细胞生长情况；培养约48-72h，达到一定细胞密度后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。更进一步地，当鸭胚细胞衍生的传代细胞密度达到6×106/mL-15×106/mL时，可用于鸭肝炎病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×106/mL～10×106/mL时，用于接毒。更进一步地，鸭肝炎病毒接毒量为0.001MOI-1MOI之间接种，优选的0.01MOI。更进一步地，所述的二阶培养法接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为33℃-35℃，优选为33℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为110rpm。更进一步地，病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积2倍的生产培养基。更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养基中含有10-100mg/L氨基酸、1-10mg/L维生素、100-500mg/L无机盐、1000-8000mg/L葡萄糖、0.01-1mg/L微量元素、0.1-10mg/L生长因子，其中氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、色氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种，所述维生素选自维生素C、生物素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、吡哆醛、维生素B12、核黄素、盐酸硫胺素中的一种或多种，所述无机盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或多种，所述微量元素选自硫酸锰、亚硒酸钠、硝酸铁中的一种或多种，所述生长因子选自胰岛素、EGF、bFGF中的一种或多种。该培养基属于无血清、化学界定培养基。进一步地，所述鸭肝炎病毒为弱毒株GD75株(由强毒GD株在鸡胚连续传代75代致弱)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。本专利技术相对于现有技术具有如下有益效果：1、鸭胚细胞衍生的传代细胞系，属于鸭源细胞，对鸭肝炎病毒具有更高的敏感性和适应性，利用该细胞培养鸭肝炎病毒滴度高(可达到109.0ELD50/mL以上)，相比于传统的鸡胚培养(108.0ELD50/mL左右)提高至少一个滴度，具有明显的优势。2、鸭胚细胞衍生的传代细胞为全悬浮传代细胞，属于非贴壁依赖性细胞，具有传代方便(不需消化处理)，易于收获细胞等特点，且细胞密度最高可达3,000万个细胞/mL。相比于传统的贴壁细胞培养，细胞收获量大大增加。因细胞密度的增加，病毒增殖滴度也随之提高，生产出的病毒疫苗无需经过浓缩等下游繁琐的程序，大大节约了成本。3、鸭胚细胞衍生的传代细胞为无血清全悬浮细胞。对于传统的微载体悬浮培养和培养基需要添加血清的培养方式，鸭胚细胞衍生的传代细胞用于病毒疫苗的制备无需微载体，从而可以突破细胞生长需要基质表面贴附的限制，还可以节约设备空间，提高设备利用率，真正意义上实现大规模培养；并且采用本细胞培养病毒制备疫苗，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养；步骤2：对步骤1所得的细胞进行鸭肝炎病毒的接种培养；步骤3：接毒后，每隔12‑18h取样测定病毒的ELD50，在病毒ELD50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭肝炎病毒。

【技术特征摘要】
1.一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养；步骤2：对步骤1所得的细胞进行鸭肝炎病毒的接种培养；步骤3：接毒后，每隔12-18h取样测定病毒的ELD50，在病毒ELD50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭肝炎病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2的鸭肝炎病毒接种方法为二阶培养法，所述步骤2的操作方式如下：待全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸭肝炎病毒的接种，接毒完成后，将摇瓶放置于5％CO2培养箱中，在低转速下吸附0.5h-2h；吸附完成后补加病毒培养基，并放回到5％CO2培养箱中，调节合适转速，继续培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤4：取步骤3所得培养后的鸭肝炎病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用二阶培养法，将病毒接种至全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获鸭肝炎病毒为鸭胚细胞衍生的传代细胞的适应毒。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞复苏与传代培养方法如下：从液氮中取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入约20倍体积的细胞培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，使用细胞培养基将细胞吹打重悬均匀，细胞悬液接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养；每隔24h少量取样一次进行细胞计数，通过检查细胞密度和细胞活力等参数，监测细胞生长情况；培养约48-72h，达到一定细胞密度后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次...

【专利技术属性】
技术研发人员：温良海，陈瑞爱，蔡仕君，叶俊贤，谭银娟，
申请(专利权)人：华农肇庆生物产业技术研究院有限公司，华南农业大学，肇庆大华农生物药品有限公司，甘肃健顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44