一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及干细胞领域。本发明专利技术初步建立一种脐带、胎盘干细胞分离培养培养体系及应用。所述方法包括：（1）新生胎儿脐带、胎盘的处理与运输；（2）脐带、胎盘冲洗、切割、消化处理；（3）原代细胞及组织快细致处理；（4）全新添加物、传代换液处理。本发明专利技术可以在节约成本的基础上更高效率分离培养脐带、胎盘间充质干细胞。

An efficient method for isolating umbilical cord placental mesenchymal stem cells and its application

The present invention relates to the field of stem cells. The invention preliminarily establishes a system for isolation, culture and application of umbilical cord and placental stem cells. The method includes: (1) treatment and transportation of umbilical cord and placenta of newborn fetus; (2) washing, cutting and digestion of umbilical cord and placenta; (3) rapid and meticulous treatment of primary cells and tissues; (4) treatment of new additives and replacement fluid. The invention can isolate and culture umbilical cord and placental mesenchymal stem cells more efficiently on the basis of cost saving.

【技术实现步骤摘要】
一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用
本专利技术涉及干细胞领域，尤其是分离培养人脐带、胎盘间充质干细胞的方法，在培养中我们添加了胎盘组织液，最大程度上模拟了细胞原本生长环境，使得细胞起步更平稳、增殖更快。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育阶段分为两类:胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（MSC），是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。最初MSC提取大多数来自骨髓，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性大，直接影响了骨髓MSC的临床应用，替代骨髓MSC的间充质干细胞来源迫在眉睫。脐带、胎盘是产妇生产后的“废弃物”。脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’sJelly，外层由羊膜来源的上皮包裹。胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由羊膜层、蜕膜层等组成。脐带的Wharton’sJelly、胎盘的羊膜层和蜕膜层中有着丰富的间充质干细胞，而且相对骨髓间充质干细胞具有更高的增殖能力，更低的免疫原性以及更高的分化潜能，而且采集过程简单，无任何危害损伤及伦理学困扰。以上原因使脐带、胎盘间充质干细胞更适合临床的应用。但是，脐带、胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，传统的方法不仅对脐带、胎盘来源细胞伤害大，回收效率低，杂细胞多，细胞增殖速率慢，而且污染风险大，本专利技术恰恰从来源上保证安全无污染，而且提供了一个简单和高效的脐带、胎盘组织分离、培养、冻存间充质干细胞的方法，足以满足医药、科研、临床等领域的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有获取脐带、胎盘间充质干细胞方法的缺陷，提供一种实用简单的从脐带、胎盘中大量分离间充质干细胞的方法。本专利技术采用方法回收率和纯度，增殖能力比传统方法都有显著提高，而且无污染确保在临床中的安全应用。1.来源上，我们选取经过严格身体筛查的产妇及胎儿的脐带、胎盘，确保健康，确保没有遗传病、确保没有感染性疾病及病原体携带，确保无污染，并且会留有产妇及胎儿信息留档以便查证；2.脐带、胎盘取出后经由专业有资质的人员处理，用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，避免红细胞裂解，造成细胞内物质污染脐带、胎盘组织，将脐带、胎盘放入保存液中，低温冷链2-8℃全程监控快速运输到实验室，即到即处理（72h内）；3.脐带、胎盘组织进入实验室必须遵守严格制度，登记相应表格，交由专业人员快速用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，选取质量较好部分，用经过121℃，103.4kPa灭菌的手术器械，剥离组织块；4.将组织块进一步切割成1-3mm3大小浸润在PBS溶液中，组织消化液37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h；5.根据方法4，组织消化液包含胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶中的一种或多种酶，0.25%胰酶、0.05-0.2%的EDTA、0.1-1%胶原酶Ⅱ、Ⅳ、0.1mg/mL分散酶、0.1-0.2%脂肪酶，相对单一酶消化效率显著提高；6.根据方法4，37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h，方法多元，更加适合大量样本处理；7.消化结束后，经200目筛网过滤，细胞滤液1200-1600rpm离心10分钟，再用PBS冲洗一次，然后经羟乙基淀粉或Ficoll分离液2000rpm无升降离心20min，纯化所需单细胞，滤网内的组织块经消化后比较松散，研磨会造成细胞损伤，所以采用PBS冲洗一次，1000rpm离心10min；8.将细胞和组织块分别接种到T75细胞培养瓶，细胞密度在0.5-1*106/ml,每瓶10mlMSC培养基，37℃，5%CO2，培养3-4天后，如果出现大克隆，胰酶消化，添加新鲜培养基及20-50%经过2000rpm离心原液重贴，掉落的组织块重新再贴，采用这样的换液方法对细胞环境影响较小，对数期会延长；9.根据方法8，在MSC培养基中添加胎盘组织液、EGF因子、胰岛素等因子，更好的模拟胎盘环境，让细胞快速增殖；10.8-10天左右，细胞融合会达到90%,0.01%胰酶消化传代，每T75瓶接种1*106/ml,每瓶10ml,2-3天融合率会达到90%，传代不超过7代；11.细胞冻存1*106/支，每支1ml，冻存液采用10%DMSO、10%人白、30%羟乙基淀粉、50%MSC培养基，程序降温，最后液氮保存，严格记录，随用随取；12.根据方法10、11，每一次的传代和冻存都做留样处理，并做安全监测；细胞培养前后、冻存、复苏；细胞数目、活率及表型检测；安全性检测包括以下一项或多项：细菌、真菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、人白残留、抗生素残留等；生物学效力包括其免疫抑制力检测，客户资料、培养时间、各项数据统一归档附图说明：图1是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞光镜观察图（200×）。图2是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞成脂、成骨分化能力图（200×）。（成脂分化：箭头所指为脂滴；成骨份化：箭头所指为钙化结节）图3是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞流式检测表面标志图。具体实施方式实施例1、一、试剂胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶，胎盘组织液、EGF因子，胰岛素，羟乙基淀粉，DMSO购自sigma公司。无血清的MSC培养基为公司自制。保护液配制：为公司自制消化液配制：胰蛋白酶浓度：0.25%，胶原酶Ⅱ：0.5mg/ml,胶原酶Ⅳ：1mg/ml分散酶浓度：0.1mg/ml。二、取材、运输、分离，扩增和冻存材料取自健康孕妇分娩或剖腹产后废弃的脐带、胎盘，要求孕妇有完整的健康体检报告，不能有遗传疾病，感染性疾病及携带，在取材过程中严格按照无菌操作。所用的脐带、胎盘是必须在分娩或剖腹产后2小时之内。然后由专业人员用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水清洗血污，放入无菌包装袋内。无菌包装袋放入冷链运输箱中保持2-8℃，72小时之内运到实验室分离。再次用含有青/链霉素（100U/ml/100μg/ml）和酮康唑（0.1mg/L）的生理盐水冲洗，选取活性好的部位，剥离组织块，并用无菌剪刀剪成1-3mm3的小块，每个50ml离心管内加入10ml小组织块和20ml消化液。先置于37℃恒温摇床中按照60-240rpm，摇动15-50分钟。消化结束后，经100-200目筛网过滤，细胞滤液收集到新的50ml离心管，离心1200-1600转/分，离心10分钟，弃上清，PBS重悬，离心1200-1600转/分，离心10分钟弃上清，加10mlPBS重悬。进一步提纯采用羟乙基淀粉离心法，6%的羟乙基淀粉溶液与重悬细胞按1:5混合，2000rpm，10℃，20min离心，离心完毕后吸取上层到新的离心管中。按1：3比例加入PBS,1200rpm5min，离心清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术建立一种高效分离培养脐带、胎盘干细胞的方法：A.取材安全；B.冷链运输，全程监控，安全运输；C.进一步处理组织，挑选好的部位；D.组织消化液分散细胞；E.筛网过滤细胞，密度梯度离心进一步提纯细胞，保留组织块；F.用添加胎盘组织液的MSC培养基，37℃，5% CO2培养箱培养；G.传代或冻存细胞；H.质量安全、生物学效力检测，保障培养安全、细胞纯度及增殖分化能力。

【技术特征摘要】
1.本发明建立一种高效分离培养脐带、胎盘干细胞的方法：A.取材安全；B.冷链运输，全程监控，安全运输；C.进一步处理组织，挑选好的部位；D.组织消化液分散细胞；E.筛网过滤细胞，密度梯度离心进一步提纯细胞，保留组织块；F.用添加胎盘组织液的MSC培养基，37℃，5%CO2培养箱培养；G.传代或冻存细胞；H.质量安全、生物学效力检测，保障培养安全、细胞纯度及增殖分化能力。2.根据权利要求1的方法，其步骤A，所用脐带、胎盘可以是人自然分娩或剖腹产后废弃的胎盘；产妇必须经过健康体检，无遗传病、感染性疾病或携带者，以及其他疾病，严格无菌操作；脐带、胎盘必须新鲜（0-2小时内）。3.根据权利要求1的方法，其步骤B,将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，清洗液可以是含有青链霉素和咪康唑的生理盐水；脐带、胎盘全程冷链运输，全程监控，安全运输指将胎盘放入脐带、胎盘保存液中，低温冷链全程监控快速运输到实验室，即到即处理（0-72小时），提高安全等级，做到安全效率。4.根据权利要求1的方法，其步骤C，用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗脐带、胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，最后一次用纯净的PBS冲洗，选取质量较好部分，剥离组织块，这样保证我们培养的细胞更加安全、活力高。5.根据权利要求1的方法，其步骤D,将组织块进一步切割成1-3mm3大小浸润在新的PBS溶液中，不含抗生素和胎牛血清，避免造成残留，组织消化液37...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：中晶生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11