一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法技术

本发明专利技术属于菌种保藏技术领域，尤其涉及一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法。一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。利用该保藏剂对基因工程菌进行保藏的方法是将菌种保藏剂放入厌氧管中通氮气排氧后高温灭菌；基因工程菌培养至对数生长期，取新鲜菌液等体积与无菌厌氧菌种保藏剂混合，此过程通氮气排氧后置于‑20℃或‑80℃下冷冻保藏。厌氧冷冻保藏方法能够达到严格厌氧，最大限度降低菌种的基础代谢水平，复苏率高，解决了基因工程菌质粒易丢失的问题，能够保证复壮后的基因工程菌高效维持外源DNA片段相应的功能。

A strain preservative and a method for preserving genetically engineered bacteria by anaerobic freezing with this preservative

The invention belongs to the technical field of strain preservation, in particular to a strain preservative and a method for preserving genetically engineered bacteria by anaerobic freezing with the preservative. A strain preservative comprises the following components: 50 to 80 low temperature preservatives, 2 to 5 antibiotic selectors and 5 to 8 dispersants. The method of preservation of genetically engineered bacteria with this preservative is to sterilize the bacteria at high temperature by putting the preservative in the anaerobic tube and venting nitrogen to oxygen. The genetically engineered bacteria are cultured to logarithmic growth stage and mixed with the preservative of aseptic anaerobic bacteria in the same volume with fresh bacterial liquid. In this process, the preservative is frozen at 20 C or 80 C after the nitrogen gas is exhausted. Anaerobic freezing preservation method can achieve strict anaerobic, minimize the basic metabolic level of bacteria, high recovery rate, solve the problem of easily lost plasmids of genetic engineering bacteria, and ensure that the rejuvenated genetic engineering bacteria efficiently maintain the corresponding function of exogenous DNA fragments.

【技术实现步骤摘要】
一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法
本专利技术属于菌种保藏
，尤其涉及一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法。
技术介绍
菌种保藏在微生物研究及实际应用中必不可少，由于微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在长时间内使其不发生变异而又能够保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所述菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。低温冷冻保藏是菌种保藏最直接、最简单也是最常用的方法之一，具有保存费用低、不容易发生变异、操作简单、保存时间长等优点。其中保藏剂对于微生物的存活率有较大的影响，能够在保藏过程中保护菌体细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，减低细胞受到的生理损伤。基因工程菌株中含有由载体质粒等携带的外源DNA片段，这些片段通常是遗传不稳定的，在传代过程中很容易丢失其外源质粒复制子，在菌种保藏和复壮阶段也很容易因丢失外源质粒而影响基因工程菌株的相关功能。
技术实现思路
为解决基因工程菌在超低温保藏和菌种复壮过程中容易丢失外源质粒复制子的问题，本专利技术提供了一种菌种保藏剂及利用该保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法。本专利技术的技术方案：一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。进一步的，所述保藏剂还含有0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。进一步的，所述低温保护剂为甘油、DMSO或丙三醇中的一种。进一步的，所述抗生素选择剂为卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素中的一种或几种的组合。进一步的，所述卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素均为浓度为20～25mg/L的液体，且经0.22μm滤膜过滤除菌后再加入保藏剂。进一步的，所述分散剂由3～5份脱脂牛奶和2～3份低聚糖组成。进一步的，所述低聚糖为海藻糖、蔗糖或麦芽糖中的一种。一种利用本专利技术所述菌种保藏剂厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法，所述方法步骤如下：步骤一、将菌种保藏剂放入厌氧管中，向厌氧管中通一定时间氮气后，盖上厌氧管的塞子和盖子，121℃高温灭菌20min待用；步骤二、将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，在通氮气的情况下用将步骤一得到的无菌厌氧菌种保藏剂加入装有新鲜菌液的厌氧管中，向此厌氧管中通一定时间氮气，盖上塞子和盖子，置于-20℃或-80℃下冷冻保藏。进一步的，步骤一和步骤二中向厌氧管中通氮气的时间均为10～15min。进一步的，所述新鲜菌液与菌种保藏剂的体积比为1:1。本专利技术的有益效果：一、本专利技术提供的菌种保藏剂中含有低浓度的抗生素选择剂，提供了有利于携带质粒的基因工程菌细胞群体维持稳定的生长选择压，可以帮助维持质粒复制与染色体复制的协调，保证基因工程菌在超低温保藏和菌种复壮过程中维持由载体质粒携带的外源DNA片段的遗传稳定性，能够有效防止质粒的丢失。二、本专利技术提供的菌种保藏剂通过低温保护剂产生的氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定基因工程菌细胞成分的构型，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。低聚糖和脱脂牛奶等则可为细胞提供能量，防止其衰亡，使细胞可以长时间维持生命活力，延长保藏期。三、本专利技术提供的厌氧冷冻保藏基因工程菌的方法，使菌种保藏剂和保藏过程都能够达到严格厌氧，最大限度地降低菌种的基础代谢水平，对有氧、严格厌氧或兼性厌氧的基因工程菌都能起到良好的保护作用，能够保护基因工程菌质粒稳定，复苏率高，并且既可以用于菌种的-20℃的冷冻保藏，也可用于-80℃的超低温冷冻保藏，有效延长菌种的保藏期达十年以上。四、本专利技术提供的保藏方法操作简便，储存方便，细菌生存期长，-80℃保藏1年后复壮的菌体成活率高达96％，复壮后的基因工程菌仍能够保有外源DNA片段相应的功能。一株高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌应用本专利技术菌种保藏剂和保藏方法在-80℃保藏1年后，复壮的菌株发酵生产丙酮酸的产量较保藏前仅下降了5％。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。实施例2一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂、5～8份分散剂和0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。实施例3一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、3～5份脱脂牛奶、2～3份低聚糖和0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。实施例4一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：60份甘油、3份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、3份脱脂牛奶、2份海藻糖和0.2份的谷氨酸钠。实施例5一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：70份DMSO、5份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、4份脱脂牛奶、3份蔗糖和0.3份的L-半胱氨酸。实施例6一种菌种保藏剂，所述保藏剂含有如下质量份的组分：80份丙三醇、4份卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素、5份脱脂牛奶、3份麦芽糖和0.4份的L-半胱氨酸。上述实施例中使用的抗生素卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素均为浓度为20～25mg/L的液体，且经0.22μm滤膜过滤除菌后再加入保藏剂，具体加入卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素哪一种取决于基因工程菌携带的质粒的选择性，可根据实际情况进行调整。实施例7利用实施例6制备的菌种保藏剂对一株高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌进行菌种保藏，其中使用的抗生素选择剂为浓度为23mg/L氨苄青霉素和氯霉素各2份，具体方法步骤如下：步骤一、将菌种保藏剂放入厌氧管中，向厌氧管中通10～15min氮气后，盖上厌氧管的塞子和盖子，121℃高温灭菌20min待用；步骤二、将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，在通氮气的情况下用针筒和针头将步骤一得到的无菌厌氧菌种保藏剂加入装有新鲜菌液的厌氧管中，所述新鲜菌液与菌种保藏剂的体积比为1:1，向此厌氧管中通10～15min氮气，盖上塞子和盖子，混匀后置于-20℃下冷冻保藏。对比例1使用实施例6制备的菌种保藏剂对与实施例7一样的高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌进行菌种保藏，其中使用的抗生素选择剂为浓度为23mg/L氨苄青霉素和氯霉素各2份，本对比例对菌种保藏剂不进行厌氧处理，直接将基因工程菌用LB培养基37℃培养过夜至对数生长期，取新鲜菌液装入厌氧管，再将与新鲜菌液等体积的菌种保藏剂加入厌氧管，不做通氮气排氧的操作直接盖上塞子和盖子，混匀后置于-20℃下冷冻保藏。一、复壮存活率及基因工程菌功能验证试验将实施例7培养的高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌培养液，在菌种保藏前进行菌落计数，培养液稀释至10-7时，涂布平板的平均菌落数为26个；对此大肠杆菌基因工程菌进行常规发酵培养，得到丙酮酸产量为65g/L；经实施例7菌种保藏方法-20℃冷冻保藏一年后，进行常温复壮，传代3代后，用LB培养基37℃培养过夜至对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菌种保藏剂，其特征在于，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。

【技术特征摘要】
1.一种菌种保藏剂，其特征在于，所述保藏剂含有如下质量份的组分：50～80份低温保护剂、2～5份抗生素选择剂和5～8份分散剂。2.根据权利要求1所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述保藏剂还含有0.1～0.5份的谷氨酸钠或L-半胱氨酸。3.根据权利要求1或2所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述低温保护剂为甘油、DMSO或丙三醇中的一种。4.根据权利要求3所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述抗生素选择剂为卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素中的一种或几种的组合。5.根据权利要求4所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述卡那霉素、氨苄青霉素或氯霉素均为浓度为20～25mg/L的液体，且经0.22μm滤膜过滤除菌后再加入保藏剂。6.根据权利要求5所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所述分散剂由3～5份脱脂牛奶和2～3份低聚糖组成。7.根据权利要求6所述一种菌种保藏剂，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪，张斯欧，
申请(专利权)人：哈尔滨艾诺卫康科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23