一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法及其应用技术

一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法及其应用，属于植物提取发酵技术领域，可解决酸枣野生资源的需求量增加而出现的酸枣叶资源浪费的问题，该方法通过将粉末化的酸枣叶总黄酮加入培养好的肠道菌孵育液中进行培养后制得。分别应用于DPPH、O2

Preparation and Application of Total Flavone Fermentation Products from Jujube Leaves with Strong Antioxidant Activity

The preparation method and application of total flavonoids from jujube leaves with strong antioxidant activity belong to the field of plant extraction and fermentation technology, which can solve the problem of waste of jujube leaves resources caused by increasing demand for wild resources of jujube. The method is prepared by adding powdered total flavonoids from jujube leaves into the incubation liquid of cultured intestinal bacteria. They are applied to DPPH and O2 respectively.

【技术实现步骤摘要】
一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法及其应用
本专利技术属于植物提取发酵
，具体涉及一种通过肠道菌发酵酸枣叶总黄酮的方法及其发酵产物在提高酸枣叶总黄酮抗氧化活性中的应用。
技术介绍
酸枣原产中国，为我国重要的药用植物资源，已有1200万年以上的历史。酸枣的果实、根、叶均可入药，其干燥成熟种子酸枣仁为临床常用养心安神中药。但是除其种子外，在酸枣生长过程中产生的大量枝叶资源缺乏有效利用途径而多被废弃。酸枣叶为鼠李科枣属植物酸枣ZiziphusjujubaMill.Var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥叶子。酸枣叶又名棘叶，始载于《本草纲目》，具有“敛疮解毒，治胫臁疮”之功效。酸枣叶中含有丰富的黄酮、皂苷、氨基酸、核苷、微量元素等营养成分，现代药理研究表明，酸枣叶有明显的镇静安神、抗氧化、保护肝脏等多种保健功效。课题组前期研究表明，酸枣叶黄酮具有较强抗氧化活性，并多以糖苷形式存在。然而，黄酮糖苷类成分生物利用度低，口服后在体内难直接发挥作用。大量文献报道，黄酮糖苷类成分通常需经肠道菌代谢生成苷元，苷元作为活性成分在结肠内被吸收，进入血液循环而发挥作用。此外，药理表明，糖苷类成分相应的代谢产物苷元具有比糖苷更强的活性甚至可以产生新的活性。例如柚皮苷的肠道菌代谢产物（柚皮素）具有比柚皮苷更高的抗氧化活性。橙皮苷不具有抗过敏活性，但其代谢产物表现出了抗过敏活性。
技术实现思路
本专利技术针对酸枣野生资源的需求量增加而出现的酸枣叶资源浪费的问题，提供一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法及其应用，拓宽酸枣仁生产加工副产品-酸枣叶的利用率。本专利技术采用如下技术方案：一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法，包括如下步骤：第一步，酸枣叶总黄酮的制备：将酸枣叶浸泡在乙醇溶液中，回流提取两次，合并滤液，挥干滤液中的溶剂，得到酸枣叶提取物固体，将酸枣叶提取物固体通过大孔树脂层析柱，收集洗脱液，挥干洗脱液的溶剂，得到酸枣叶总黄酮提取粉末；第二步，酸枣叶总黄酮溶液的配制：将酸枣叶总黄酮提取粉末溶解于无菌水中，得到酸枣叶总黄酮溶液；第三步，配制厌氧菌培养液：称取GAM肉汤加热溶解至蒸馏水中，得到液体培养基，分装后，在液体培养基中添加氯化血红素和维生素K1，高压灭菌，得到厌氧菌培养液；第四步，制备肠道菌液：取3名健康男性新鲜粪便和3名健康女性新鲜粪便混合均匀后，与DPBS以质量体积比为1g：10mL的比例混合均匀，用两层脱脂棉纱布过滤，将滤液离心，取上清液，得到肠道菌液；第五步，制备肠道菌孵育液：将厌氧菌培养液与肠道菌液按比例混合，厌氧培养，得到肠道菌孵育液；第六步，重复上述步骤，分别制备22份肠道菌孵育液，向其中20份肠道菌孵育液中分别加入酸枣叶总黄酮溶液，在厌氧培养箱中分别培养若干时间，用水饱和的正丁醇萃取，停止反应，得到具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物，再用水饱和的正丁醇萃取两次，合并3次离心后的上清液，减压浓缩蒸干，-20℃保存备用，另外2份肠道菌孵育液加入无菌水作为空白对照，在厌氧培养箱中培养24h，采用同样的方法萃取，合并3次离心后的上清液，减压浓缩蒸干，-20℃保存备用；第一步中，酸枣叶和乙醇的质量体积比为500g：6L，乙醇浓度为50%，浸泡时间为3h，每次回流提取的时间为0.5h，通过大孔树脂层析柱的过程如下：将酸枣叶提取物固体，上D101大孔树脂，上样浓度23.85mg.mL-1，以0.5BV/h的流速通过树脂柱，用蒸馏水洗去杂质，再用50%乙醇以1BV/h流速洗脱。第二步中，无菌水为115℃下，高压灭菌15min的无菌水，得到的酸枣叶总黄酮溶液浓度为8mg·mL-1。第三步中，所述GAM肉汤包括如下成分：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨3.0g，可溶性淀粉6.0g，硫代乙醇酸钠0.5g，无水亚硫酸钠0.1g，氯化钠2.5g，0.025%w/v的刃天青4mL，L-半胱氨酸0.25g；取GAM肉汤23.6g于500mL蒸馏水中，分装后，每100mL液体培养基中添加0.5mg氯化血红素和0.1mg维生素K1，115℃高压灭菌15min。第四步中，3名健康男性和3名健康女性均要求饮食健康、无消化道疾病、前3月内未服用抗菌药物，粪便收集前48h避免含酒精类食物；滤液在2000r·min-1离心10min。第五步中，厌氧菌培养液与肠道菌液的体积比为1:1，37℃厌氧培养箱中培养9h。第六步中，肠道菌孵育液与酸枣叶总黄酮溶液的体积比为20:1，在37℃厌氧培养箱中分别培养0h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，12h，24h，36h取出，每个时间点平行制备2份样品，肠道菌孵育液样品和空白对照样品与水饱和的正丁醇的体积比均为1:1，2000r·min-1离心10min后得到上清液，70℃减压浓缩蒸干。一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物分别应用于DPPH、O2-•自由基的清除、Fe3+的还原及其对H2O2诱导PC12细胞的细胞活力。本专利技术的有益效果如下：本专利技术采用人体肠道菌体外孵育法对酸枣叶总黄酮进行发酵，得到抗氧化活性更高，且更容易吸收的发酵产物，以拓宽酸枣仁生产加工副产品酸枣叶的利用率，并解决因对酸枣野生资源的需求量增加而出现的酸枣叶资料浪费的问题。附图说明图1为本专利技术的制备方法流程图；图2为不同浓度的酸枣叶总黄酮在人体肠道菌中发酵不同时间对DPPH自由基清除率，（x±s，n=4）注：与0h组比较清除率降低，#P<0.05；##P<0.01，###P<0.001；与0h组比较清除率增加*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图3为不同浓度的酸枣叶总黄酮在人体肠道菌中发酵不同时间对O2-•的清除率，（x±s，n=4）注：与0h组比较清除率降低，#P<0.05；##P<0.01，###P<0.001；与0h组比较清除率增强，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图4为不同浓度的酸枣叶总黄酮在人体肠道菌中发酵不同时间对Fe3+的还原能力，（x±s，n=4）注：与0h组比较吸光度降低，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与0h组比较吸光度增加，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图5为不同浓度的酸枣叶总黄酮在人体肠道菌中发酵不同时间对PC12细胞活力的影响，（x±s，n=5）注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图6为不同浓度的酸枣叶总黄酮在人体肠道菌中发酵不同时间对H2O2损伤的PC12细胞ROS含量的影响，（x±s，n=5）注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与无菌组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：第一步，酸枣叶总黄酮的制备：将酸枣叶浸泡在乙醇溶液中，回流提取两次，合并滤液，挥干滤液中的溶剂，得到酸枣叶提取物固体，将酸枣叶提取物固体通过大孔树脂层析柱，收集洗脱液，挥干洗脱液的溶剂，得到酸枣叶总黄酮提取粉末；第二步，酸枣叶总黄酮溶液的配制：将酸枣叶总黄酮提取粉末溶解于无菌水中，得到酸枣叶总黄酮溶液；第三步，配制厌氧菌培养液：称取GAM肉汤加热溶解至蒸馏水中，得到液体培养基，分装后，在液体培养基中添加氯化血红素和维生素K1，高压灭菌，得到厌氧菌培养液；第四步，制备肠道菌液：取3名健康男性新鲜粪便和3名健康女性新鲜粪便混合均匀后，与DPBS以质量体积比为1g：10mL的比例混合均匀，用两层脱脂棉纱布过滤，将滤液离心，取上清液，得到肠道菌液；第五步，制备肠道菌孵育液：将厌氧菌培养液与肠道菌液按比例混合，厌氧培养，得到肠道菌孵育液；第六步，重复上述步骤，分别制备22份肠道菌孵育液，向其中20份肠道菌孵育液中分别加入酸枣叶总黄酮溶液，在厌氧培养箱中分别培养若干时间，用水饱和的正丁醇萃取，停止反应，得到具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物，再用水饱和的正丁醇萃取两次，合并3次离心后的上清液，减压浓缩蒸干，‑20℃保存备用，另外2份肠道菌孵育液加入无菌水作为空白对照，在厌氧培养箱中培养24h，采用同样的方法萃取，合并3次离心后的上清液，减压浓缩蒸干，‑20℃保存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：第一步，酸枣叶总黄酮的制备：将酸枣叶浸泡在乙醇溶液中，回流提取两次，合并滤液，挥干滤液中的溶剂，得到酸枣叶提取物固体，将酸枣叶提取物固体通过大孔树脂层析柱，收集洗脱液，挥干洗脱液的溶剂，得到酸枣叶总黄酮提取粉末；第二步，酸枣叶总黄酮溶液的配制：将酸枣叶总黄酮提取粉末溶解于无菌水中，得到酸枣叶总黄酮溶液；第三步，配制厌氧菌培养液：称取GAM肉汤加热溶解至蒸馏水中，得到液体培养基，分装后，在液体培养基中添加氯化血红素和维生素K1，高压灭菌，得到厌氧菌培养液；第四步，制备肠道菌液：取3名健康男性新鲜粪便和3名健康女性新鲜粪便混合均匀后，与DPBS以质量体积比为1g：10mL的比例混合均匀，用两层脱脂棉纱布过滤，将滤液离心，取上清液，得到肠道菌液；第五步，制备肠道菌孵育液：将厌氧菌培养液与肠道菌液按比例混合，厌氧培养，得到肠道菌孵育液；第六步，重复上述步骤，分别制备22份肠道菌孵育液，向其中20份肠道菌孵育液中分别加入酸枣叶总黄酮溶液，在厌氧培养箱中分别培养若干时间，用水饱和的正丁醇萃取，停止反应，得到具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物，再用水饱和的正丁醇萃取两次，合并3次离心后的上清液，减压浓缩蒸干，-20℃保存备用，另外2份肠道菌孵育液加入无菌水作为空白对照，在厌氧培养箱中培养24h，采用同样的方法萃取，合并3次离心后的上清液，减压浓缩蒸干，-20℃保存备用。2.根据权利要求1所述的一种具有强抗氧化活性的酸枣叶总黄酮发酵产物的制备方法，其特征在于：第一步中，酸枣叶和乙醇的质量体积比为500g：6L，乙醇浓度为50%，浸泡时间为3h，每次回流提取的时间为0.5h，通过大孔树脂层析柱的过程如下：将酸枣叶提取物固体，上D101大孔树脂，上样浓度23.85mg.mL-1，以0.5BV/h的流速通过树脂柱，用蒸馏水洗去杂质，再用50%乙醇以1BV/h流速洗脱。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫艳，付彩，杜晨晖，裴香萍，杜会枝，李震宇，
申请(专利权)人：山西大学，山西中医药大学，
类型：发明
国别省市：山西,14