一种环氧胡萝卜烯醛A和B在抗造血干细胞衰老方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环氧胡萝卜烯醛A和B在抗造血干细胞衰老方面的应用。造血干细胞经历自我更新、分化、衰老与死亡等复杂过程而维持机体终生血细胞产生；机体在衰老过程中造血系统的基本成分虽得以维持，但造血干细胞的功能和数量却逐渐降低，这导致机体造血功能降低、免疫功能衰退。本发明专利技术发现，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。

Application of epoxy carotene aldehyde A and B in anti-aging of hematopoietic stem cells

The invention discloses an application of epoxy carotene aldehyde A and B in anti-aging of hematopoietic stem cells. Hematopoietic stem cells undergo complex processes such as self-renewal, differentiation, aging and death to maintain the production of lifelong hematopoietic cells. Although the basic components of the hematopoietic system are maintained during aging, the function and quantity of hematopoietic stem cells are gradually reduced, which leads to the decline of hematopoietic function and immune function. The invention discovers that epoxy carotene aldehyde A, epoxy carotene aldehyde B, rose acid A or rose acid D can resist the senescence of hematopoietic stem cells by inhibiting the transcription of p16 gene. Epoxy carotene aldehyde A, epoxy carotene aldehyde B, rose acid A or rose acid D can be made into p16 gene transcription inhibitors and anti-senescence drugs of hematopoietic stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种环氧胡萝卜烯醛A和B在抗造血干细胞衰老方面的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及造血干细胞抗衰老，具体涉及一种环氧胡萝卜烯醛A和B在抗造血干细胞衰老方面的应用。
技术介绍
造血干细胞经历自我更新、分化、衰老与死亡等复杂过程而维持机体终生血细胞产生。机体在衰老过程中造血系统的基本成分虽得以维持，但造血干细胞的功能和数量却逐渐降低，这导致机体造血功能降低、免疫功能衰退。目前认为衰老是一种与基因相关的疾病，抑癌基因p16是调控细胞衰老的关键基因。研究已经证实，细胞衰老时，p16基因的转录及蛋白质表达水平增高，抑制细胞有丝分裂，刺激发生反应而产生RB蛋白的磷酸化，从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态。抑制p16基因的转录及蛋白表达可以抑制细胞衰老。环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B和玫瑰酸D为重瓣玫瑰花中的成分，其化学结构如图1所示。目前尚未见这些化合物抗造血干细胞衰老的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种环氧胡萝卜烯醛A和B在抗造血干细胞衰老方面的应用。本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：环氧胡萝卜烯醛A或环氧胡萝卜烯醛B用作p16基因转录抑制剂的用途。环氧胡萝卜烯醛A或环氧胡萝卜烯醛B用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。一种用于抗造血干细胞衰老的药物制剂，以环氧胡萝卜烯醛A或环氧胡萝卜烯醛B为活性成分，制成药学上可以接受的剂型。有益效果：本专利技术发现，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。附图说明图1为各化合物结构式；图2为各组造血干细胞中p16mRNA表达水平；图3为各组造血干细胞SA-β-Gal染色结果；图4为各组造血干细胞混合集落培养结果。具体实施方式下面结合实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料健康清洁级C57BL/6J小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18～20g，由中国药科大学动物中心提供。环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B和玫瑰酸D自制，纯度≥98％，干燥保存。Anti-Sca-1MicroBeadKit购自Miltenyi公司。SA-β-GalStainingKit购自CellSignaling公司。甲基纤维素培养基MethoCultGFM3434购自StemCell公司。二、实验方法1、造血干细胞衰老模型制备及分组干预C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组和给药组(包括环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B和玫瑰酸D给药组)，每组24只。模型组和给药组小鼠采用X线3.0Gy全身均匀照射(照射能量6MeV，照射源距动物的高度为100cm，照射面积为25cm×25cm，每次照射1min)每10天1次，共8次。给药组于照射当日分别灌胃给予环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B或玫瑰酸D50mg/kg，对照组和模型组灌胃给予等容量0.5％CMC-Na，隔天1次，共40次。末次照射后第10天处死。2、造血干细胞分离与纯化无菌条件下取出小鼠股骨及胫骨，分离骨髓单个核细胞(MNCs)。采用抗Sca-1+免疫磁珠分选干细胞。取(2～5)×107个MNCs加入90μLBuffer和10μLAnti-Sca-1-FITC抗体，4℃孵育15min，离心弃上清，加入80μLBuffer和20μLAnti-FITCMicroBeads，4℃孵育25min，离心弃上清，0.5mLBuffer重悬细胞，加入磁性分离柱内，分选柱用Buffer洗涤3次，加入0.5mLBuffer收集Sca-1+细胞，即分离纯化得到造血干细胞。用流式细胞仪检测Sca-1+细胞比例即为造血干细胞的纯度。3、RT-PCR检测p16mRNA表达采用Trizol方法提取各组造血干细胞的总RNA，检测完整性。取1μg总RNA，用AMV逆转录酶进行逆转录，逆转录产物PCR扩增，以GAPDH为内参，检测p16mRNA表达。引物序列如下。PCR反应体系：反转录产物1μL、Taq酶(5u/μL)0.45μL、dNTPs(10mmo1/L)1μL、含15mmol/LMg2+缓冲液5μL，GAPDH的上、下游引物各1μL，p16上、下游引物各1μL，用灭菌水补充至50μL。PCR反应条件为：93℃，30s；94℃，3min；64℃，30s；71℃，1min；35个循环，71℃，7min。以p16灰度值/GAPDH灰度值之比表示p16mRNA的相对值。p16mRNA上游引物：5′-CCATGTCCAAAAGTGGTGTAAT-3′p16mRNA下游引物：5′-ATGGATGCATTGAGTGAAGTA-3′GAPDH上游引物：5′-GACGCCTATCGGTTAGTC-3′GAPDH下游引物：5′-GAACTGTGCGTCTCTGTC-3′4、造血干细胞衰老指标检测SA-β-Gal染色：收集各组1×105个造血干细胞，加Fixative工作液1mL充分混匀，固定10min；PBS洗涤2次，加入含SolutionA，SolutionB，StainingSolution三者的工作液1mL混匀，37℃、无CO2条件下孵育16h，甘油封片镜检，以随机计数的400个细胞中阳性细胞的个数计算阳性细胞率。混合集落培养：收集各组1×104个造血干细胞，离心弃上清，加甲基纤维素半固体培养基1mL混匀，接种于96孔板，在37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱孵育10～12d，依接种造血干细胞数量与形成混合集落形成单位(CFU-Mix)的数量评价造血干细胞的多向分化能力。5、统计学分析采用SPSS19.0统计学软件，实验重复3次，数据资料用均值±标准差表示，样本均数比较采用组间t检验。P<0.05为差异有显著性意义。三、实验结果1、造血干细胞纯度检测分离纯化后Sca-1+细胞纯度达(90.55±7.24)％，提示分选的Sca-1+HSCs纯度较高。2、各组造血干细胞中p16mRNA表达水平结果如表1和图2所示，与对照组相比，模型组造血干细胞中p16mRNA表达水平显著升高，说明p16与造血干细胞衰老有关；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组造血干细胞中p16mRNA表达水平显著降低，说明环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D通过抑制p16转录抑制了造血干细胞的衰老。玫瑰酸B对p16转录水平无明显影响。表1各组造血干细胞中p16mRNA表达水平3、各组造血干细胞SA-β-Gal染色结果各组造血干细胞SA-β-Gal染色阳性百分比如表2和图3所示，与对照组相比，模型组SA-β-Gal染色阳性百分比显著升高；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组SA-β-Gal染色阳性百分比显著降低；玫瑰酸B给药组SA-β-Gal染色阳性百分比与模型组比较无显著差异。表2各组造血干细胞SA-β-Gal染色结果4、各组造血干细胞混合集落培养结果各组造血干细胞CFU-Mix如表3和图4所示，与对照组相比，模型组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环氧胡萝卜烯醛A或环氧胡萝卜烯醛B用作p16基因转录抑制剂的用途。

【技术特征摘要】
1.环氧胡萝卜烯醛A或环氧胡萝卜烯醛B用作p16基因转录抑制剂的用途。2.环氧胡萝卜烯醛A或环氧胡萝卜烯醛B用于制备抗造血干细胞衰老的药...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑嘉荣，区伟平，
申请(专利权)人：淮安安莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32