利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法技术

本发明专利技术提供了利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法，具体地本发明专利技术的方法使用高精确性的二代测序平台，避免对目标区域富集、建库等繁琐操作，克服了现有基于直接测序的检测技术操作复杂、费用昂贵、准确性不高的缺陷，是一种简单快速、低成本、高精确性的血浆游离DNA胎儿基因型的检测技术，在无创产前诊断等领域将会有广泛的应用前景。

Fetal genotype identification using maternal plasma free DNA

The invention provides a method for fetal genotype identification by using free DNA from maternal plasma. Specifically, the method of the invention uses a high-precision second-generation sequencing platform, avoids cumbersome operations such as enrichment of target regions and database building, overcomes the defects of complex operation, high cost and low accuracy of the existing direct sequencing-based detection technology, and is simple, fast, low-cost, and low-cost. High-precision detection of plasma free DNA fetal genotype will have a wide application prospect in non-invasive prenatal diagnosis and other fields.

【技术实现步骤摘要】
利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法。
技术介绍
随着对遗传病分子基础认识的不断深入，检测特异基因突变的技术能力不断提高，为发展以DNA检测为基础的无创产前诊断提供了理论和技术基础。1997年Lo等利用传统聚合酶链反应(PCR)首次发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA，不久其他学者也证实了游离胎儿DNA的存在，并已显示出其潜在的临床应用价值。胎儿游离DNA被认为是来源于胎盘滋养层细胞的破裂或是从自然凋亡的胎儿细胞中释放出来的。通过对妊娠期、产后妇女血浆中胎儿细胞内DNA和胎儿游离DNA的比较发现，59％孕妇在孕5-8周时血浆中即能检测到胎儿游离DNA，在孕7-16周时明显升高，并随孕周增加。这种胎儿游离DNA的存在为无创伤性产前诊断提供了一种新途径。因此，胎儿DNA基因型检测的技术方法开始受到研究者的广泛关注。无创产前诊断的最大难点在于胎儿游离DNA仅占母血总DNA的10％左右。因此，从母亲DNA背景下准确的判断胎儿基因型比较困难。为了有效地开展单基因遗传病的无创产前诊断，本领域迫切需要开发利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的新技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用孕妇血浆游离DNA进行胎儿基因型鉴定的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种基因型鉴定方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供针对多个待检测位点的多重PCR引物；(2)提供待测DNA、参照DNA和任选地用于位点扩增效率校正的校正DNA；其中，所述待测DNA为孕妇血浆中提取的DNA；所述参照DNA为孕妇血液白细胞中提取的基因组DNA；所述校正DNA为一个或多个正常人的基因组DNA；(3)使用步骤(1)提供的所述多重PCR引物，对相同质量的待测DNA样本和参照DNA样本分别进行多重PCR扩增；(4)对步骤(3)获得扩增产物进行高通量平行(二代)测序；(5)分析步骤(4)获得的测序数据，进行测序序列的基因位点归类，统计步骤(2)中所述每个样本中每个目标位点等位基因的测序深度；在待测DNA样本，一个目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：N1，Allele2：N2；参照DNA样本中，对应的目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：M1，Allele2：M2；校正DNA样本中，目标位点基因型为杂合的两个等位基因测序深度的平均值或中位数分别为Allele1：Q1，Allele2：Q2；(6)对参照DNA和待测DNA中等位基因的比例进行统计比较；假设某基因位点母亲的基因型为杂合Aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为Aa；若胎儿与母亲有显著差异，且N1/N2>M1/M2则胎儿基因型为AA，反之为aa；假设母亲基因型为纯合AA，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为AA；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa；假设母亲基因型为纯合aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度与母亲无显著差异，则胎儿基因型为aa；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(7)，对每个不同目标位点重复步骤(6)进行独立计算和评判。在另一优选例中，所述多重PCR引物中，每对引物5’端部分序列是与第二轮PCR扩增引物相一致的通用序列，3’端部分序列为与待检测位点所在区域特异性结合的序列。在另一优选例中，所述多重PCR引物扩增的基因组区域大小为10-200bp。在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述校正DNA为10个以上(更优选地，20个以上；最优选地，30个以上，如40个、50个、100个)正常人的基因组DNA。在另一优选例中，所述步骤(3)中分别进行两轮PCR扩增。在另一优选例中，所述步骤(4)中，高通量平行测序(二代测序)时对第二轮PCR扩增产物进行高通量高深度双端测序。在另一优选例中，所述步骤(4)中，高通量平行测序(二代测序)的测序读长≤250bp(优选地为50-250bp；更优选地为70-250bp；最优选地为100-250bp)，平均测序深度≥1000重(≥1000X；优选地≥1500X；更优选地≥2000X；最优选地≥5000X)。在另一优选例中，所述步骤(4)中，针对多重PCR得到的扩增产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对其进行扩增；优选地，PCR引物包括一段数个至数十个碱基长度的标签序列，对来自不同样本的多重扩增产物可以用带不同标签序列的PCR引物进行扩增，从而使得来自不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去。在另一优选例中，所述步骤(5)中，如果测序数据包括多个样本的数据，则步骤(5)中还包括对测序序列进行样本归类；首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上，统计每个目标位点等位基因的测序深度；同一条PCR扩增产物首尾两端所产生的序列进行相互比对以降低测序错误率：若两条序列在目标位点处的碱基组成一致则计入统计，若不一致则丢弃。在另一优选例中，所述步骤(6)中，统计比较方法包括步骤：(a)计算胎儿DNA在游离DNA中的比例，针对参照DNA样本中母亲基因型为纯合的目标位点，使用公式min(N1,N2)/(N1+N2)*2*K；若N1<N2，则K＝Q2/Q1；若N2<N1，则K＝Q1/Q2；选取所有结果大于0.5％的数值并求得平均值或中位数，即为胎儿比例F；(b)计算参照DNA中等位基因Allele2的比例Control％＝M2/(M1+M2)；计算待测DNA中等位基因Allele2的比例Plasma％＝N2/(N1+N2)；若Plasma％＝0或1，则胎儿基因型与母亲基因型相同且均为纯合；若Plasma％≠0且Control％＝0，则赋值min(M1,M2)＝n(优选地，n为远小于1000的正整数；如1-100之间的正整数；更优选地为1-10之间的正整数)并重新计算Control％；当Plasma％和Control％均不为0，但Plasma％小于Control％，则Control％＝M1/(M1+M2)，Plasma％＝N1/(N1+N2)；若Plasma％大于Control％，则进行c步计算；(c)赋值q0＝Control％，当0.2≤q0≤0.8时，q1＝q0+(1-q0)*F；当q0<0.2时，q1＝F/2；当q0>0.8时，q1＝0.99999999；用q0和q1值进行如下计算：d＝(1-q1)/(1-q0)，g＝q1*(1-q0)/(q0*(1-q1))，Upperlimit＝(ln(Z)/(N1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因型鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供针对多个待检测位点的多重PCR引物；(2)提供待测DNA、参照DNA和任选地用于位点扩增效率校正的校正DNA；其中，所述待测DNA为孕妇血浆中提取的DNA；所述参照DNA为孕妇血液白细胞中提取的基因组DNA；所述校正DNA为一个或多个正常人的基因组DNA；(3)使用步骤(1)提供的所述多重PCR引物，对相同质量的待测DNA样本和参照DNA样本分别进行多重PCR扩增；(4)对步骤(3)获得扩增产物进行高通量平行测序；(5)分析步骤(4)获得的测序数据，进行测序序列的基因位点归类，统计步骤(2)中所述每个样本中每个目标位点等位基因的测序深度；在待测DNA样本，一个目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：N1，Allele2：N2；参照DNA样本中，对应的目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：M1，Allele2：M2；校正DNA样本中，目标位点基因型为杂合的两个等位基因测序深度的平均值或中位数分别为Allele1：Q1，Allele2：Q2；(6)对参照DNA和待测DNA中等位基因的比例进行统计比较；假设某基因位点母亲的基因型为杂合Aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为Aa；若胎儿与母亲有显著差异，且N1/N2>M1/M2则胎儿基因型为AA，反之为aa；假设母亲基因型为纯合AA，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为AA；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa；假设母亲基因型为纯合aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度与母亲无显著差异，则胎儿基因型为aa；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa。...

【技术特征摘要】
1.一种基因型鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供针对多个待检测位点的多重PCR引物；(2)提供待测DNA、参照DNA和任选地用于位点扩增效率校正的校正DNA；其中，所述待测DNA为孕妇血浆中提取的DNA；所述参照DNA为孕妇血液白细胞中提取的基因组DNA；所述校正DNA为一个或多个正常人的基因组DNA；(3)使用步骤(1)提供的所述多重PCR引物，对相同质量的待测DNA样本和参照DNA样本分别进行多重PCR扩增；(4)对步骤(3)获得扩增产物进行高通量平行测序；(5)分析步骤(4)获得的测序数据，进行测序序列的基因位点归类，统计步骤(2)中所述每个样本中每个目标位点等位基因的测序深度；在待测DNA样本，一个目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：N1，Allele2：N2；参照DNA样本中，对应的目标位点两个等位基因测序深度分别为Allele1：M1，Allele2：M2；校正DNA样本中，目标位点基因型为杂合的两个等位基因测序深度的平均值或中位数分别为Allele1：Q1，Allele2：Q2；(6)对参照DNA和待测DNA中等位基因的比例进行统计比较；假设某基因位点母亲的基因型为杂合Aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为Aa；若胎儿与母亲有显著差异，且N1/N2>M1/M2则胎儿基因型为AA，反之为aa；假设母亲基因型为纯合AA，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度比例与母亲无显著差异，则胎儿基因型为AA；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa；假设母亲基因型为纯合aa，待测样本中两个等位基因测序深度分别为A：N1，a：N2，参照样本中两个等位基因测序深度分别为A：M1，a：M2，若胎儿的两个等位基因测序深度与母亲无显著差异，则胎儿基因型为aa；若有显著性差异，则胎儿基因型为Aa。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多重PCR引物中，每对引物5’端部分序列是与第二轮PCR扩增引物相一致的通用序列，3’端部分序列为与待检测位点所在区域特异性结合的序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多重PCR引物扩增的基因组区域大小为10-200bp。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，高通量平行测序时对第二轮PCR扩增产物进行高通量高深度双端测序。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，高通量平行测序的测序读长≤250bp(优选地为50-250bp；更优选地为70-250bp；最优选地为100-250bp)，平均测序深度≥1000重(≥1000X；优选地≥1500X；更优选地≥2000X；最优选地≥5000X)。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，针对多重PCR得到的扩增产物，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的PCR引物对其进行扩增；优选地，PCR引物包括一段数个至数十个碱基长度的标签序列，对来自不同样本的多重扩增产物可以用带不同标签序列的PCR引物进行扩增，从而使得来自不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，如果测序数据包括多个样本的数据，则步骤(5)中还包括对测序序列进行样本归类；首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上，统计每个目标位点等位基因的测序深度；同一条PCR扩增产物首尾两端所产生的序列进行相互比对以降低测序错误率：若两条序列在目标位点处的碱基组成一致则计入统计，若不一致则丢弃。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜正文，刘超，杨锋，
申请(专利权)人：天昊生物医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32