一种酶促联产的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶促联产的方法，该方法包括以下步骤：在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。本发明专利技术的酶促联产的方法，具有以下优点：1)在一个需要ATP的反应体系中，同时添加两种或两种以上的反应底物和相应生产用酶，可以生成多种有经济价值的产物，简化了反应工序，具有更高的产业价值；2)联产反应节省了ATP再生酶和AK酶，同时节省了反应时间，降低了水、电、人工成本等；3)使用腺苷替代传统的ATP或AMP，为工业生产节约了大量原料成本，腺苷价格低廉，来源广泛。

A method of enzymatic co-production

The invention discloses an enzymatic co-production method, which comprises the following steps: in an enzymatic reaction system, two or more reaction substrates, salt ions and adenosine are added proportionally; ATP regeneration enzyme, AK enzyme and two or more production enzymes are added to the above system to react. The method of enzymatic co-production of the present invention has the following advantages: 1) in a reaction system requiring ATP, adding two or more reaction substrates and corresponding production enzymes at the same time can produce a variety of products of economic value, simplify the reaction process and have higher industrial value; 2) the co-production reaction saves ATP regeneration enzymes and AK enzymes, and also saves reaction time and reduces reaction time. Low water, electricity, labor costs, etc. (3) The use of adenosine instead of traditional ATP or AMP saves a lot of raw material costs for industrial production, adenosine is cheap, and has a wide range of sources.

【技术实现步骤摘要】
一种酶促联产的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种酶促联产的方法。
技术介绍
三磷酸腺苷(ATP)由一个腺苷(A)和三个磷酸基团(Pi)组成，分子量为507，分子式C10H16N5O13P3。ATP分子呈A-Pi～Pi～Pi结构，远离腺苷的两个磷酸键由～表示，为高能磷酸键，在反应过程中断裂释放大量能量：当一个高能磷酸键断裂时，ATP分子转化为二磷酸腺苷(ADP)，释放能量30.5kJ/mol；当第二个高能磷酸键断裂时，ADP分子转化为腺苷酸(AMP)，可再释放能量27.6kJ/mol。ATP是生物体内能量的转换器和贮存器，被称为“能量通货”。ATP参与众多酶促反应，包括连接酶(EC6)参与的反应，如谷胱甘肽、乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素、D-丙氨酰丙氨酸、DNA和RNA等物质的合成，转移磷酸根基团的转移酶(EC2.7)所参与的酶促反应，如磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、胞苷三(二)磷酸(CT(D)P)、鸟苷三(二)磷酸(GT(D)P)、尿苷三(二)磷酸(UT(D)P)等物质的合成，腺苷转移酶参与的反应，如S-腺苷甲硫氨酸的合成，以及环化腺苷酸的合成等。目前，工业生产中直接使用ATP进行酶促反应成本过高，收益甚微。如何提高ATP的利用率以及建立稳定、有效的ATP再生体系，是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。工业上生产和再生ATP的常用方法是利用酵母菌的糖酵解途径进行底物水平磷酸化。此法参与催化反应的酶众多，反应过程复杂，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来，ATP再生的研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系，获得高效稳定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，这些酶所利用的底物价值昂贵，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸；且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反应的产物分别为乙酸和氨气，因此较难在工业生产中大量使用。腺苷由腺嘌呤和D-核糖组成，是生物体内合成ATP的前体物质，其价格相对低廉。专利CN201710453365.3使用腺苷代替ATP进行酶促反应，加入腺苷激酶(AK，EC2.7.1.20)催化腺苷生成AMP，同时使用多聚磷酸激酶(PPK，EC2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC2.7.4.3)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP，EC2.7.4.-)三种“ATP再生酶”合理组合生成和再生ATP。使用该方法加入不同底物和生产用酶，可用于生产多种单一物质，其效果稳定，产物污染较小，成本低廉。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酶促联产的方法，通过该方法可联产两种或两种以上产物，即在反应体系中，加入两种或两种以上的反应底物和相应生产用酶，同时添加腺苷激酶(AK)和ATP再生酶，生成两种或两种以上有经济价值的物质，进一步降低生产成本。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种酶促联产的方法，所述方法包括以下步骤：(1)在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；(2)向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶进行反应。优选地，上述技术方案中，所述反应体系的反应条件如下：反应温度为：25-60℃，优选温度为30-50℃；反应pH为：5-10，优选pH为6-9；反应体系包含：底物；腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液；在反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。优选地，上述技术方案中，所述反应体系还包括：铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；和/或Tris或磷酸根离子的一种或两种组合。优选地，上述技术方案中，腺苷浓度为4E-5-0.18M；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。优选地，上述技术方案中，钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.5M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。优选地，上述技术方案中，ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合。即使用PPK和ADK组合，或ADK和PAP组合，或PPK和PAP组合，或PPK、ADK和PAP的组合。上述的ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。优选地，上述技术方案中，ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶；其中，PPK酶浓度为0.01-5000U/L、ADK酶浓度为0.01-5000U/L、PAP酶浓度为0.01-5000U/L、AK酶浓度为0.01-8000U/L，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。优选地，上述技术方案中，钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种。优选地，上述技术方案中，所述酶促联产反应为需要ATP的酶促反应，所述底物和生产用酶为联产产物对应需要的底物和生产用酶，所述联产产物为谷胱甘肽、乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素、D-丙氨酰丙氨酸、DNA、RNA、磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、胞苷三(二)磷酸(CT(D)P)、鸟苷三(二)磷酸(GT(D)P)、尿苷三(二)磷酸(UT(D)P)、S-腺苷甲硫氨酸和环化腺苷酸的至少两种。优选地，上述技术方案中，上述所有酶可通过基因工程改造、发酵、纯化获得，或以自然提取等其它方式获得；酶可以游离的形式制成酶液或者干粉，也可进一步固定于固定化载体上，制得固定化酶。优选地，上述技术方案中，酶是通过下列方式固定于固定化载体：吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合；所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙或合成高聚物等；无机载体选自于多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭或硅藻土。优选地，上述技术方案中，本专利技术添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。上述酶促合成反应所需的生产用酶及底物见本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶促联产的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；(2)向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。

【技术特征摘要】
1.一种酶促联产的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；(2)向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。2.根据权利要求1所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件如下：反应温度为：25-60℃，优选温度为30-50℃；反应pH为：5-10，优选pH为6-9；反应体系包含：底物；腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液；在反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。3.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，所述反应体系还包括：铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；和/或Tris或磷酸根离子的一种或两种组合。4.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，腺苷浓度为4E-5-0.18M；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。5.根据权利要求3所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.5M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。6.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘珊珊，刘辉，周稳文，秦永发，
申请(专利权)人：深圳市古特新生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44