一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。由SS0713分泌产生的尼卡巴嗪单克隆抗体，用于食品安全检测中尼卡巴嗪残留的分析检测。此细胞株分泌的单克隆抗体，对尼卡巴嗪具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.05 ng/mL），可实现对鸡肉、鸡的肝脏和饲料中尼卡巴嗪残留量的检测，为食品中尼卡巴嗪残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

A Hybridoma Cell Line Containing Monoclonal Antibody to Nicabazine and Its Application

A monoclonal antibody hybridoma cell line of nicabazine and its application belong to the field of food safety immunoassay. A nicabazine monoclonal antibody hybridoma cell line SS0713 has been preserved in the General Microbial Center of the Chinese Microbial Species Preservation and Management Committee, CGMCC for short, Preservation Number CGMCC No. 14691, Preservation Address No. 3 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 1 North Chenxi Road, Chaoyang District, Beijing, Preservation Date: Sept. 5, 2017. The monoclonal antibody against nicabazine secreted by SS0713 was used for the analysis of nicabazine residues in food safety detection. The monoclonal antibody secreted by this cell line has good specificity and detection sensitivity for nicabazine (IC50 value is 0.05 ng/mL). It can detect nicabazine residues in chicken, chicken liver and feed. It provides raw materials for the immunoassay of nicabazine residues in food and has practical application value.

【技术实现步骤摘要】
一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
尼卡巴嗪（Nicarbazin，DNC）是一种饲料添加剂，驱虫保健剂，对各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，不易产生耐药性和交叉抗药性，排泄迅速，残留量极低。尼卡巴嗪对鸡盲肠球虫和堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、波氏艾美尔球虫均有良好的预防效果，具有高效、低毒、性能稳定、抗药性小等优点，与球虫酯联合用药效果更佳。尼卡巴嗪对球虫第二代裂殖体有效，推荐量不影响鸡对球虫产生免疫力，且安全性较高，高温季节慎用，产蛋期禁用。尼卡巴嗪的两种成分能分别由家禽消化道吸收，并广泛分布于组织及体液中。尼卡巴嗪已被广泛应用于农业、畜禽和饲料等领域。因此尼卡巴嗪在动物组织、肌肉和饲料中一般都有一定的残留，而人体摄入尼卡巴嗪过多会对人类的肝肾等器官造成代谢负担，若在动物蛋白（鸡肉、鸡蛋、奶）中，有尼卡巴嗪残留，则有害于人体健康。国家标准GB/T29691-2013将尼卡巴嗪(DNC)作为允许使用的饲料添加剂，同时也规定了其最高允许使用限量（0.02mg/kg）和最高允许残留量（0.1mg/kg）。中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN0216-1993中也规定了出口禽肉中尼卡巴嗪的残留量标准，规定其允许残留量（0.03mg/kg-1.20mg/kg）。但是这些标准都采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对DNC的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对尼卡巴嗪的高特异性单克隆单体。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713及其应用，由该细胞株制备的抗体对尼卡巴嗪具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立尼卡巴嗪的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。尼卡巴嗪单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.14691的尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713分泌产生。所述尼卡巴嗪单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中尼卡巴嗪残留的分析检测。本专利技术提供的尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713的制备基本步骤为：（1）半抗原的衍生：尼卡巴嗪原药为：半抗原：用尼卡巴嗪原药衍生出氨基。（2）完全抗原DNC-BSA的制备：称取4.38mgDNC衍生物，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL1mol/Ld的HCL进行酸化0.5h；再称取150mg亚硝酸钠(DIA)，用500μL纯水充分溶解后，加入5.56μL亚硝酸钠溶液到DNC衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1h(称为A液)。取6mgBSA（DNC与牛血清白蛋白BSA摩尔比为60：1），用2mL0.01M碳酸盐缓冲溶液（CB,pH=9.0）溶解（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DNC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；（3）小鼠的免疫：将完全抗原DNC-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713；（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。完全抗原DNC-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫用DNC完全抗原（25μg/只，不含佐剂）进行小鼠腹腔注射。取特异性高，IC50低的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆，得到一株高分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株SS0713分泌的单克隆抗体，对DNC具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.05ng/mL），可实现对鸡肉和鸡的肝脏、饲料中DNC残留量的检测，为食品中DNC残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。附图说明图1是尼卡巴嗪单克隆抗体的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将尼卡巴嗪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对尼卡巴嗪具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株SS0713的制备（1）完全抗原的合成：称取4.38mgDNC衍生物，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL1mol/LHCL进行酸化0.5h；再称取150mg亚硝酸钠(DIA)，用500μL纯水充分溶解后，加入5.56μL亚硝酸钠溶液到DNC衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1h(称为A液)。取6mgBSA（DNC与牛血清白蛋白（BSA）摩尔比为60：1），用2mL0.01M碳酸盐缓冲溶液（CB,pH=9.0）溶解（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DNC-BSA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。

【技术特征摘要】
1.一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。2.尼卡巴嗪单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.14691的尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713分泌产生。3.权利要求2所述尼卡巴嗪单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中尼卡巴嗪残留的分析检测。4.制备权利要求1所述细胞株SS0713采用的完全抗原的制备方法，其特征是步骤如下：（1）半抗原的衍生：尼卡巴嗪原药为：半抗原：用尼卡巴嗪...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，许晓昕，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32