一种蛙来源的创伤修复肽及其合成方法技术

本申请提供了一种新的蛙创伤修复肽及其合成方法。本申请的合成方法操作简便，所获得的蛙创伤修复肽在合成之后是直接是环形肽，无需经过变复性的过程。同时，本申请的合成方法能以高产率获得目的多肽。并且，通过本申请的方法制备的蛙创伤修复肽中引入了C‑S键替换容易断裂的S‑S键，从而稳定了蛋白质的空间构象，获得了很好的稳定性。

A wound repair peptide from frog and its synthesis method

This application provides a new frog wound repair peptide and its synthesis method. The synthetic method of this application is simple and convenient. The obtained frog wound repair peptide is a cyclic peptide directly after synthesis, and does not need to undergo a refolding process. At the same time, the synthetic method of this application can obtain the target polypeptide in high yield. Furthermore, the frog wound repair peptide prepared by the method in this application introduced C_S bond to replace the fragile S_S bond, thus stabilizing the spatial conformation of the protein and obtaining good stability.

【技术实现步骤摘要】
一种蛙来源的创伤修复肽及其合成方法
本申请属于生物医药领域，涉及一种新的多肽及其合成方法。更具体地，涉及一种新的蛙创伤修复肽及其合成方法。
技术介绍
许多因素会造成细胞和组织的损伤。损伤后组织部位及其附近存活的健康细胞不断进行分裂和增殖，以取代死亡细胞和修复受损组织，生物体的这种生理机能称为再生和修复。正常情况下，人体不同器官的修复和再生能力有所不同。表皮细胞(如呼吸道、消化管和泌尿生殖器的粘膜被覆上皮)、淋巴细胞、造血细胞等属于再生力强的细胞，这些种类的细胞每时每刻都在进行衰老与新生，具有应对损伤的强大再生修复能力，因此属于再生能力较强的细胞。而其他如血管内皮细胞、骨膜细胞、各种腺体器官的细胞如肝、胰、内分泌腺、汗腺、皮脂腺及肾小管上皮细胞等则属于次一级的有较强再生力的细胞，当受到损伤时，也能表现出一定的再生能力。具体反映在局部组织当这些正常的细胞被破坏后，由残留的同类细胞分裂、补充；而如果该局部的细胞完全被破坏，细胞全部坏死，则该部位就不能被修复。另外，还有再生力微弱或无再生力的细胞，如中枢神经细胞和神经节细胞再生很弱，遭损坏后极难恢复原有功能；心肌细胞再生能力极弱，损毁后均由纤维结缔组织代替，很难恢复原有的结构和功能。影响组织再生的因素有很多。除了组织和细胞自身的再生能力外，还有如下几种因素：(1)组织受损伤的程度和范围：程度和范围越大则修复和再生的时间越长，因为大范围的细胞坏死后，难以有相当数量的同类细胞代替，需要健康的细胞产生新细胞，新生细胞再生成新细胞，需要的时间就要漫长一些。(2)年龄因素：儿童和青少年组织再生能力强，创伤愈合快；老年人组织再生能力弱，愈合慢。(3)营养状况：充足的蛋白质、维生素C、E和矿物质钙、锌供应能够促进损伤的修复，反之则会延缓各种损伤的修复。(4)药物影响：有些药物如肾上腺皮质激素和垂体促肾上腺皮质激素能抑制炎症，但不利于机体消除伤口感染，还能抑制肉芽组织生长和胶原合成，加速胶原分解；还有抗癌药中的细胞毒药物也可延缓愈合。(5)血液供应：组织损伤后，由于局部毛细血管也受到破坏，或者其他因素导致血管硬化等，都会导致血液供应不足而导致组织营养不良，妨碍愈合。(6)神经支配：失去神经支配的组织会丧失再生能力。由上可知，机体的组织受到损失后，除却无法通过外界干预的如年龄等客观因素外，从增加受损部位的营养供给、采用药物干预其促进存活细胞增殖、促进毛细血管的新生和神经细胞的再生等，可以加快组织的修复。本申请主要涉及皮肤组织的创伤修复。皮肤是人体面积最大的且最直接与外界接触组织，同时也是最容易受到外界刺激而损伤的器官。正常创伤的愈合对维持机体稳态至关重要，而异常愈合如大面积烧烫伤造成的不愈或者迟愈、其他疾病导致的慢性创面愈合、以及不正常的愈合如病理性瘢痕的形成等等不仅影响了美观，更会造成结构和功能的障碍，往往对患者造成沉重的心理压力，严重影响着患者的身心健康。因此，如何在皮肤创伤治疗中快速达到最佳愈合效果，一直是人们研究的热点。皮肤的愈合过程是一个复杂的、协调有序的组织修复再生过程，是多种细胞及细胞因子共同作用完成的过程。该过程大致可以分为炎症反应期、增生期和重塑期，三个期相互交叉并无严格的界线，且均有大量的细胞及细胞因子参与愈合过程。参与愈合的细胞包括角质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞和肥大细胞等；参与愈合的细胞因子包括成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor，FGF)、血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、血小板衍生因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、转化生长因子(Transforminggrowthfactor，TGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactors，IGF)和多种凝血因子等。细胞分泌细胞因子调节创伤愈合，细胞因子又反过来影响细胞的功能，其中任何一个环节的异常都可能造成皮肤愈合结果的异常，而且皮肤愈合过程受到的影响因素众多(年龄、营养状况、内分泌变化、药物、局部血液循环、感染、电离辐射和系统性疾病等)，因此，皮肤愈合的机制目前仍不完全明确。目前临床上，皮肤创伤修复主要针对急性皮肤软组织创伤、慢性皮肤软组织创伤来进行不同的用药和处理。基于我国传统中医药的优势，在创伤修复领域涌现了许多单方如康复新液，复方则由少则四、五味，多则二三十味中药进行配伍制备而来，例如治疗烧烫伤的“湿润烧伤膏”、“京万红”等。现代医药开发特别是基因工程技术介入的生物医药开发后，促细胞生长的重组生长因子的生产也是创伤修复药物开发的生力军，比如已经在临床上应用于创伤、烧烫伤等的生物技术药物--外用重组碱性成纤维细胞生长因子(basicFibroblastGrowthFactor，bFGF)，就是我国第二个基因工程I类新药(注：碱性成纤维细胞生长因子又称为成纤维细胞生长因子-2，FGF2)。与皮肤修复的多肽药物开发方面，2014年中科院昆明动物研究所报道了来源于蜥蜴的一条强效的皮肤修复肽Tylotoin，含12个氨基酸残基，表现出强烈的促创伤愈合活性，可以促进角质上皮和成纤维细胞的增殖和迁移，还能促进TGF-b和IL-6的生成。两栖动物的生活环境复杂，它们的皮肤裸露、光滑、潮湿，容易受到各种病原微生物侵袭和紫外线辐射损伤。在长期的自然选择过程中，两栖动物逐渐进化出了独特的、高效的皮肤多肽防御系统。广泛的研究表明：两栖动物皮肤受到创伤后能快速修复，因此两栖动物皮肤被视为具有巨大开发潜力的促创伤修复药物资源宝库。两栖动物皮肤包含丰富的小分子多肽，这些小分子肽具有各种生物活性，如抗菌性、抗氧化性以及免疫活性。目前，从两栖动物皮肤中筛选一些药理活性单体化合物是新药专利技术的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床阶段。然而，到目前为止，对于两栖动物皮肤具有皮肤促创伤修复活性多肽的认知还非常匮乏。在这方面，天然蛙创伤修复肽是一种发现于绿臭蛙表皮分泌物中，并经分离纯化得到的天然多肽。这种多肽具有促进成纤维细胞的分裂以及迁移，和促进伤口愈合的能力。因此，该多肽具有药物开发的潜能。目前获得这种蛙创伤修复肽的方法主要有以下两种：一种是直接从绿臭蛙表皮分泌物中提取，然后通过反相高效液相色谱C18柱分离纯化，以便直接从表皮分泌物中分离单一的组分。通过这种方法可以获得天然创伤修复肽，但是这种方法的缺点在于得到的天然修复肽的量非常微小。例如1毫克皮肤分泌物经过分离纯化，仅仅可以获得微克级的目的多肽。因此，这种提取方法不适合大规模生产操作。另一种方法是采用化学合成来制备。这种合成方法通过在自动化肽合成仪上进行固相肽合成来获取粗制直链产物，之后再进行二硫键重构和HPLC纯化过程，从而得到目的多肽。由于增加了二硫键重构和HPLC纯化步骤，往往会导致复性效率较低，目的多肽的产率降低。因此，本领域急需高效地获得蛙创伤修复肽的方法。专利技术概述本申请提供了合成一种高效的蛙来源的创伤修复肽的方法，这种方法操作简便，所获得的蛙创伤修复肽在合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛙创伤修复肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸之间的S‑S键被替换为C‑S键。

【技术特征摘要】
1.一种蛙创伤修复肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸之间的S-S键被替换为C-S键。2.权利要求1中的蛙创伤修复肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，SEQIDNo.1为LVGKLLKGAVGDVCGLLPIC，且其中从C端至N端第1位与第7位之间的S-S键被替换为C-S键。3.权利要求1中的蛙创伤修复肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，SEQIDNo.2为PFCFKGTPCG，且其中从C端至N端第2位与第8位之间的S-S键被替换为C-S键。4.权利要求1中的蛙创伤修复肽的合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)按照蛙创伤修复肽的序列由C端至N端合成其序列所示的至少包括第1个半胱氨酸至第2个半胱氨酸前一位的氨基酸在内的肽段，其中所述肽段从C端至N端第1个半胱氨酸是二氨基二酸；2)脱除二氨基二酸的保护基团；3)将上述二氨基二酸与所述肽段从C端至N端第2个半胱氨酸前一位的氨基酸环化缩合；4)从C端至N端合成蛙创伤修复肽的剩余肽段，从而获得所述蛙创伤修复肽。5.权利要求4中的蛙创伤修复肽的合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)按照SEQIDNo.1所示的序列由C端至N端合成SEQIDNo.1所示的多肽的至少包括第1个半胱氨酸至第2个半胱氨酸前一位的氨基酸在内的肽段，其中从SEQIDNo.1的C端至N端第1个半胱氨酸是二氨基二酸；2)脱除二氨基二酸的保护基团；3)将所述二氨基二酸与从C端至N端第2个半胱氨酸前一位的氨基酸环化缩合；4)从C端至N端合成SEQIDNo.1所示的多肽的剩余的肽段，从而获得所述蛙创伤修复肽。6.权利要求5中的蛙创伤修复肽的合成方法，其特征在于，在所述步骤1)中从SEQIDNo.1的C端至N端1位是二氨基二酸，优选地在所述步骤3)中从C端至N端第2个半胱氨酸前一位的氨基酸是从C端至N端6位氨基酸。7.权利要求6中的蛙创伤修复肽的合成方法，其特征在于，在所述步骤1)中按照SEQIDNo.1所示的序列由C端至N端合成SEQIDNo.1所示的多肽的6位氨基酸。8.权利要求4中的蛙创伤修复肽的合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)按照SEQIDNo.2所示的序列由C端至N端合成SEQIDNo.2所示的多肽包括第1个半胱氨酸至第2个半胱氨酸前一位的氨基酸在内的肽段，其中从SEQIDNo.2的C端至N端第1个半胱氨酸是二氨基二酸；2)脱除二氨基二酸的保护基团；3)将所述二氨基二酸与SEQIDNo.2从C端至N端第2个半胱氨酸前一位的氨基酸环化缩合；4)从C端至N端合成SEQIDNo.2所示的多肽的剩余的肽段，从而获得所述蛙创伤修复肽。9.权利要求8中的蛙创伤修复肽的合成方法，其特征在于，在所述步骤1)中从SEQIDNo.2的C端至N端2位是二氨基二酸，优选地在所述步骤3)中从C端至N端第2个半胱氨酸前一位的氨基酸是从C端至N端7位氨基酸。10.权利要求8中的蛙...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓奇，肖亮，李冬，
申请(专利权)人：武汉帕肽生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42