本发明专利技术公开了一种来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括细胞的体外培养、化学方法进行第一阶段脱细胞处理、物理方法进行第二阶段脱细胞处理、DNA酶/RNA酶处理及细胞外基质的存储几个步骤。本发明专利技术方法通过物理、化学和生物酶学手段有效除去细胞中的DNA成分，脱细胞后得到的细胞外基质中DNA残留含量低于2%，同时有效保留了基质结构蛋白及其超微结构。本发明专利技术方法制备的细胞外基质应用于再生医学中的生物材料表面修饰时表现出促进干细胞增殖及分化潜能的生物学特性。
Preparation and application of extracellular matrix derived from in vitro culture
The invention discloses a preparation method of extracellular matrix derived from in vitro culture, which includes cell culture in vitro, chemical method for first stage acellular treatment, physical method for second stage acellular treatment, DNA enzyme/RNA enzyme treatment and storage of extracellular matrix. The method of the invention effectively removes DNA components in cells by physical, chemical and biological enzymatic means, and the residual content of DNA in the extracellular matrix obtained after acellular removal is less than 2%, while the matrix structural protein and its ultrastructure are effectively retained. The extracellular matrix prepared by the method of the invention has the biological characteristics of promoting the proliferation and differentiation potential of stem cells when applied to the surface modification of biomaterials in regenerative medicine.
【技术实现步骤摘要】
来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用
本专利技术涉及生物医学工程中生物材料和组织工程
，具体是一种来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用。
技术介绍
生物支架的构建及修饰一直是组织工程领域的核心研究内容。很多研究表明支架的表面特性对于植入物的重要性不亚于主体材料，而且在植入体内早期就开始调控免疫反应和细胞募集等生理过程。利用物理和化学方法在材料表面进行修饰来获得额外生物学功能的研究已非常普遍。近年来采用不同的方法诱导细胞产生特定的细胞外基质来改良支架性能的研究开始出现，其将细胞培养在支架表面，培养一定时间后，去除细胞保留细胞外基质。基质修饰复合支架不仅能为体内细胞提供正确的模板支架，模拟体内组织微环境，而且具有优异的生物学功能。脱细胞方法是此类修饰技术的核心部分，影响细胞成分残留度、细胞外基质组成、超微结构和力学性能等。现有的体外培养体系脱细胞方法氨水法，通过TritonX-100破坏细胞膜，使氨水进入细胞核，导致染色质DNA变性，然后在DNA酶和RNA酶消化后洗去细胞碎片。然而此方法脱细胞后基质DAPI染色后在荧光显微镜下依然可见清晰着色的核碎片，同时氨水也会破坏细胞外基质蛋白，特别是酸性蛋白，从而损害脱细胞后的细胞外基质的生物学活性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：(1)细胞的体外培养：将细胞培养于培养液中，当培养的细胞的汇合度达到80～90％时，弃去旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25wt％的胰酶，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至(1～2)×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，培养7～28天，即完成细胞的体外培养；(2)化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将TritonX-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5％的TritonX-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤(1)中细胞培养板中旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为200μL/cm2的配制的TritonX-100溶液，37℃静置5min；吸去细胞培养板中的TritonX-100溶液，加入37℃预热的用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；(3)物理方法进行第二阶段脱细胞处理：将细胞培养板置于-80℃/37℃反复冻融处理3次，每次的冻融处理过程如下：将细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下冰冻30～60min，然后取出细胞培养板，在超净台中除去塑料袋和封口膜，之后在细胞培养板中加入37℃预热的用量为250μL/cm2的PBS缓冲液，再将细胞培养板置于37℃静置融化30～60min；吸去细胞培养板中的PBS缓冲液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；(4)DNA酶/RNA酶处理：在PBS缓冲液中加入DNA酶和RNA酶，配制得到含有DNA酶和RNA酶的溶液，该溶液中，DNA酶的终浓度为50U/mL，RNA酶的终浓度为50μg/mL；然后在细胞培养板中加入用量为150μL/cm2的配制的含有DNA酶和RNA酶的溶液，37℃静置2h；吸去细胞培养板中的液体，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液，在细胞培养板中获得脱细胞的细胞外基质；(5)细胞外基质的存储：将含有细胞外基质的细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下存储备用。上述来源于体外培养的细胞外基质在生物材料表面修饰上的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术公开的来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，通过物理、化学和生物酶学手段有效除去细胞中的DNA成分，脱细胞后得到的细胞外基质中DNA残留含量低于2％，同时有效保留了基质结构蛋白及其超微结构。本专利技术方法制备的细胞外基质应用于再生医学中的生物材料表面修饰时表现出促进干细胞增殖及分化潜能的生物学特性。附图说明图1a为脱细胞前的实施例1中MC3T3-E1细胞的光学显微镜明场照片；图1b为脱细胞后得到的实施例1中脱细胞ECM的光学显微镜明场照片；图1c为传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM的光学显微镜明场照片；图2a为脱细胞前的实施例1中MC3T3-E1细胞在荧光显微镜下的形貌图；图2b为脱细胞后得到的实施例1中脱细胞ECM在荧光显微镜下的形貌图；图2c为传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM在荧光显微镜下的形貌图；图3为实施例1中脱细胞前MC3T3-E1细胞、脱细胞ECM与传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM的DNA含量百分比对比图；图4为实施例1中脱细胞ECM的FN蛋白和COLI蛋白量；图5为实施例1中脱细胞前MC3T3-E1细胞与两种脱细胞ECM中BSP蛋白量；图6为培养在普通细胞培养板与ECM修饰细胞培养板上的大鼠BMSCs细胞增殖情况对比图；图7为培养12天的普通细胞培养板与ECM修饰细胞培养板上的大鼠BMSCs细胞的AlizarinredS染色结果对比图；图8为培养在的SIS材料与ECM-SIS材料上的大鼠脂肪干细胞增殖曲线。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1的来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：(1)细胞的体外培养：取一瓶培养于T25细胞培养瓶的细胞汇合度为80～90％的MC3T3-E1细胞，弃去旧的培养液，加入5mL的PBS缓冲液，清洗2次；再加入1mL的0.25wt％的胰酶，前后左右倾斜细胞培养瓶，使胰酶均匀覆盖于细胞表面，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至1×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至24孔细胞培养板上，每孔加入500μL细胞悬液，细胞数量为5×104细胞/孔，再将24孔细胞培养板置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入500μL/孔新的培养液，培养7天，即完成细胞的体外培养；(2)化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将TritonX-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5％的TritonX-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤(1)中细胞培养板中旧的培养液，每孔加入400μL的PBS缓冲液，清洗2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）细胞的体外培养：将细胞培养于培养液中，当培养的细胞的汇合度达到80～90%时，弃去旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25 wt%的胰酶，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至（1～2）×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，培养7～28天，即完成细胞的体外培养；（2）化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将Triton X‑100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5%的Triton X‑100溶液，置于37℃预热；吸去步骤（1）中细胞培养板中旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为200μL/cm2的配制的Triton X‑100溶液，37℃静置5min；吸去细胞培养板中的Triton X‑100溶液，加入37℃预热的用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；（3）物理方法进行第二阶段脱细胞处理：将细胞培养板置于‑80℃/37℃反复冻融处理3次，每次的冻融处理过程如下：将细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于‑80℃下冰冻30～60min，然后取出细胞培养板，在超净台中除去塑料袋和封口膜，之后在细胞培养板中加入37℃预热的用量为250μL/cm2的PBS缓冲液，再将细胞培养板置于37℃静置融化30～60min；吸去细胞培养板中的PBS缓冲液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；（4）DNA酶/RNA酶处理：在PBS缓冲液中加入DNA酶和RNA酶，配制得到含有DNA酶和RNA酶的溶液，该溶液中，DNA酶的终浓度为50U/mL，RNA酶的终浓度为50μg/mL；然后在细胞培养板中加入用量为150μL/cm2的配制的含有DNA酶和RNA酶的溶液，37℃静置2h；吸去细胞培养板中的液体，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液，在细胞培养板中获得脱细胞的细胞外基质；（5）细胞外基质的存储：将含有细胞外基质的细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于‑80℃下存储备用。...
【技术特征摘要】
1.来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）细胞的体外培养：将细胞培养于培养液中，当培养的细胞的汇合度达到80～90%时，弃去旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25wt%的胰酶，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至（1～2）×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，培养7～28天，即完成细胞的体外培养；（2）化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将TritonX-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5%的TritonX-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤（1）中细胞培养板中旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为200μL/cm2的配制的TritonX-100溶液，37℃静置5min；吸去细胞培养板中的TritonX-100溶液，加入37℃预热的用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵基源，李梅，张迟，姜靖宇，张婷霞，毛宇星，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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