基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法，涉及病毒检测技术领域。本发明专利技术提供一组新的用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，包括以下引物和与引物配合使用的探针：E184L上游引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；E184L下游引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；探针为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。利用该组合物可以高效快速地检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。本发明专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒及利用本发明专利技术的QPCR组合物检测非洲猪瘟病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法
本专利技术涉及病毒检测
更具体地，涉及一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒的检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病。非洲猪瘟病毒属非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)，是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒,也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒，基因组长约170-190kb，编码150-200种蛋白质，不同病毒株的基因组长度差异位于基因组左端38-47kb、右端13-22kb的可变区域，中央为保守区。野猪和软蜱是非洲猪瘟病毒的野生储存宿主和传播媒介。非洲猪瘟具有和经典猪瘟相似的临床症状和病理变化，表现为发热、皮肤发绀和淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血，强毒株感染的潜伏期短，死亡率高达100％。非洲猪瘟目前无有效的疫苗用于防疫，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报疾病，我国将其列为一类动物疫病。目前，已建立的非洲猪瘟病毒检测方法包括病毒分离鉴定、病毒抗原检测和病毒核酸检测(OIE)。其中，非洲猪瘟病毒的分离鉴定试验周期长，不适合快速检测。采用荧光抗体试验和抗原捕获试验检测非洲猪瘟病毒抗原，具备快速、准确的特点，但敏感性偏低，易出现假阴性结果；常规PCR方法的特异性高，成本低，但是敏感性低；荧光定量PCR技术具有高效快捷、敏感性高、特异性强等优点，已在非洲猪瘟病毒核酸检测方面得到应用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，利用该组合物可以高效快速地检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。本专利技术的第二个目的在于提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒。本专利技术的第三个目的在于提供一种利用本专利技术的QPCR组合物检测非洲猪瘟病毒的方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，包括以下引物和与引物配合使用的探针：E184L上游引物为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；E184L下游引物为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；探针为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。优选地，所述探针在5’端标记FAM，3’端标记BHQ。本专利技术还提供一种如上所述的QPCR组合物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。根据本专利技术的第二个目的，本专利技术还提供一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的QPCR组合物。优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。优选地，所述阳性对照为包括E184L基因序列的重组质粒。根据本专利技术的第三个目的，本专利技术还提供一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测方法，所述检测方法包括：提取样品的基因组DNA；配制QPCR反应体系，所述反应体系包括如上所述QPCR组合物；将配制的QPCR反应体系转移至96孔板中，进行QPCR扩增反应；结果判定。优选地，所述QPCR反应体系中E184L上游引物和E184L下游引物的浓度均为0.4μM，所述探针的浓度为0.2μM。优选地，所述QPCR扩增反应的退火温度为59.5℃。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的QPCR组合物以及利用该QPCR组合物检测非洲猪瘟病毒的方法，是用于检测非洲猪瘟病毒早期表达基因E184L的产品和方法。由于E184L基因的转录本在病毒感染早期就可以在感染动物的血液中检测到，且E184L基因的编码产物也是非洲猪瘟病毒的一种免疫显著抗原，且该基因还具有较高的序列保守性，所以E184L基因作为非洲猪瘟病毒早期检测靶基因，可以更早更及时地检测出非洲猪瘟病毒。此外，本专利技术提供的QPCR组合物可以高效快速地检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出本专利技术实施例4中得到的ASFVE184L基因熔解曲线。图2示出本专利技术实施例4中ASFVE184L基因不同Tm值扩增曲线图。图3示出本专利技术实施例4中ASFVE184L基因不同引物浓度得到的扩增曲线。图4示出本专利技术实施例4中ASFVE184L基因不同探针浓度得到的扩增曲线。图5示出本专利技术实施例4中ASFVE184L基因的扩增曲线。图6示出本专利技术实施例4中ASFVE184L基因的标准曲线。图7示出本专利技术实施例4中不同病毒中ASFVE184L基因扩增曲线。其中，1是指阳性对照重组质粒(0.6×104copies)；2是指伪狂犬病毒；3是指PCV2；4是指PPV；5是指阴性对照。图8示出本专利技术实施例4中不同细胞系的ASFVE184L扩增曲线。其中，1是指阳性对照重组质粒(0.6×105copies)；2是指整合E184L基因PK-15细胞系184-2；3是指整合E184L基因PK-15细胞系184-13。具体实施方式目前已报道的荧光定量PCR方法所采用的引物和标记探针，主要是针对非洲猪瘟病毒的P54、VP72、K205R、CP530R和CP204L等基因序列设计制备的，而用于检测非洲猪瘟病毒早期表达基因E184L的荧光检测试剂产品及其使用方法尚未见报道。E184L基因是非洲猪瘟病毒的一个早期表达基因，该基因的转录本在病毒感染早期就可以在感染动物的血液中检测到。此外，E184L基因的编码产物也是非洲猪瘟病毒的一种免疫显著抗原，因此E184L基因具有作为非洲猪瘟病毒早期检测靶基因的良好前景。鉴于此，本专利技术提供一组新的用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物及检测方法。根据GenBank中公布的格鲁吉亚猪ASFV的基因组序列(FR682468.1)的E184L基因序列选定E184L基因的扩增区域(如SEQIDNo.1所示)，设计六对特异性引物、一条特异性探针。本专利技术中的序列和探针均由华大基因合成。E184L基因的扩增区域如SEQIDNo.1所示：ATGAAGACGTTTATTACATGCACTTCGGTGAAAAACTACTTTCGCCAACATTTGAAAACCAACCAAAGAATCAGCTCAGAGCTTATTAGCTACGTGTGCACCATTCTAAACCATATCTGCCATCAGTATCTTCAGAATCCGCAAGCCCAAGAGGAGGAATGGTTTGCCCTGATCAAGGAACTTCCCATCATCAAAGATGGGCTCTCGAAGGAGGAAAGATTCTTCTCCTCAGGTGTGAAACACTTTCTACATGAATATAAAATCACACCCGAAAACCAAGAAAAATTCCAGAAAATGCTTAACGCCATTACAGAACAACTGATGAGTCGGCTTTGCAAGGTGTTTTCAATTATGATTCAACGTCAGGGTTTTCTTAAAACGCAAACCCTTATGTATTCTCACCTGTTTACCATTCTAAGCATCCTTATGGTCGCAGATAACCTGTACGGGGAACAAGATCCCACGGAGTTCTTTTCCCTTATTATAGAACAAACAAAAACGATTAAGAAAAAGAAGAAGAGTGGCTCGGAGGAGGAAGAGAGCCACGAGGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的探针：E184L上游引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；E184L下游引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；探针为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的探针：E184L上游引物为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；E184L下游引物为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；探针为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的QPCR组合物，其特征在于，所述探针在5’端标记FAM，3’端标记BHQ。3.一种如权利要求1或2所述的QPCR组合物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。4.一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1或2所述的QPCR组合物。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霆，崔贝贝，仇松寅，王娜，冯春燕，韩雪清，吴绍强，林祥梅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11