本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB‑28突变位点的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供了与其相关的载体、细胞、基因编辑试剂盒及其应用，特别是基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB‑28突变位点的方法，其包括使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的sgRNA构建CRISPR/Cas9表达载体。本发明专利技术能够特异性的诱导HBB‑28地中海贫血中基因突变位点的无痕定向改造，能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变，极大地促进精确修复的提高。
【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB-28突变位点的sgRNA、载体及应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种针对HBB-28地中海贫血的致病性点突变的CRISPR质粒构建方法，以及设计高效准地修复单碱基突变donor的方案。
技术介绍
β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(α2β2)的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成α与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。β地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白转录启示区的TATA盒-28点突变(A→G)是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一。据报道，全世界约有4亿地中海贫血症基因携带者。在我国，该疾病好发于南方地区，尤其是广东省境内发生率远远高于其他省份。2012年对广东省21个地市共14332个户籍住院分娩孕妇的筛查研究发现，地贫基因携带率为16.8％，即高达1/6育龄人群携带地贫基因。每例重症地贫患儿的出生给社会和家庭带来的经济负担高达100万到300万元。目前可通过终生输血治疗地中海贫血症，然而绝大多数患儿在积极治疗的情况下仍在成年前死亡。另一种治疗方法则是通过骨髓或造血干细胞移植，但要找到相匹配的异体捐赠者非常困难，且费用不菲。目前只能通过胚胎植入前行遗传学诊断技术或通过胎儿脐血细胞基因检测技术筛选正常的胚胎或胎儿来阻断地贫致病基因的传播。通过利用基因编辑工具CRISPR精确特异性修复患者体细胞β珠蛋白基因(hemoglobinsubunitbeta，HBB)缺陷基因，然后将基因编辑与修复后的体细胞诱导成多能干细胞，最后移植入体内，从而分裂和分化为相应有功能的红细胞，来治疗和缓解β-地中海贫血患者症状。目前，针对β型地中海贫血的基因治疗，着手对象已从诱导型多能干细胞(iPS)和造血干细胞(HSC)过渡到人类胚胎，直接阻断该遗传性疾病的垂直传播。2015年在世界上首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异常授精的人类3PN受精卵进行HBB基因编辑修复，观测到CRISPR/Cas9对人胚胎中靶基因切割效率达到51.9％，但同时发现脱靶明显。2017年，申请者再次利用单碱基编辑系统(APOBEC1)以及核移植技术，第一次在人类胚胎中实现了单碱基编辑，成功地对导致β-地中海贫血的一种单核苷酸突变-28位突变进行校正。这种单碱基编辑系统由CRISPR-Cas9的变体与胞嘧啶脱氨酶构成，通过导向RNA直接指向正确DNA位置，用胸腺嘧啶(T)替换鸟嘌呤(C)。基因修复效率仅仅只有23％，并且修复后得到胚胎仍然是嵌合体，被修复的卵裂球也只有20％，很难实现完全治愈，且操作起来复杂繁琐。除此之外，该方法也存在较高的脱靶率。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种技术方案，其能够精准地编辑HBB-28型突变位点。为此，本专利技术提供了一种sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种载体，其包括核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的sgRNA。优选地，所述载体是CRISPR/Cas9表达载体。更优选地，所述载体是pX330。本专利技术还提供了一种细胞，其包括上述载体。本专利技术还提供了核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的sgRNA用于编辑HBB-28突变位点的应用。本专利技术还提供了一种基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB-28突变位点的方法，其包括使用核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的sgRNA构建CRISPR/Cas9表达载体。根据本专利技术的基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB-28突变位点的方法，优选还包括使用供体(donor)ssDNA，该供体ssDNA为HBB-28突变位点附近的100bp碱基序列，在其中引入HBB-28致病突变和无义突变，并在两端进行硫代修饰。更优选地，在该供体ssDNA中引入HBB-28致病突变和无义突变，即将HBB-28的基因表达区上游TATAbox-28位碱基由A(腺嘌呤)突变为G(鸟嘌呤)，且HBB-28突变点后的第2位碱基由A(腺嘌呤)突变为C(胞嘧啶)。优选地，供体ssDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，并对供体ssDNA两端的碱基进行硫代修饰，优选在3’端和5’端各两个碱基进行硫代修饰。根据本专利技术的基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB-28突变位点的方法，优选地，包括以下具体步骤：(1)设计并合成所述sgRNA，将Cas9序列和所述sgRNA克隆到CRISPR/Cas9载体上，构建含有Cas9序列和所述sgRNA的CRISPR/Cas9表达载体；(2)设计并合成所述供体ssDNA，所述供体ssDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(3)将所述CRISPR/Cas9质粒和所述供体ssDNA共转染293T细胞，并进行培养。本专利技术针对HBB-28突变的地中海贫血这一转录起始区点突变的常染色体隐性遗传病，构建相应的靶向地中海贫血中该突变位点的CRISPR/Cas表达质粒，同时采用5’和3’端两个碱基硫代修饰的ssDNA(单链寡核苷酸)，并在其中利用氨基酸简并性原理引入阻断再次编辑的无义突变，合成为donor，将CRISPR/Cas表达质粒和donor二者共同转染到细胞中，在293T细胞中特异性的诱导HBB-28地中海贫血中基因突变位点的无痕定向改造，能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变，极大地促进精确修复的提高。附图说明图1是正常人(纯合无突变)、轻型HBB-28地贫患者(杂合突变)和重型HBB-28地贫患者(纯合突变)的血液DNA测序结果比较。图2示出了CRISPR/Cas9质粒和donor-ssDNA共转染293T细胞后，细胞基因组DNA的测序结果。图3是T7E1酶切实验结果。图4是T7E1酶切实验结果进行灰度分析量化后所计算的酶切效率及整合效率结果对比。图5是三种不同样品的目标片段测序结果比较。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的详述，但本专利技术并不限于以下实施例。如未特别指出，以下所涉及的试剂均可通过商业途径购得。为简便起见，部分操作未详述操作的参数、步骤及所使用的仪器，应当理解，这些都是本领域技术人员所熟知并可重复再现的。CRISPR/Cas9基因编辑系统是来源于化脓性链球菌的细菌适应性免疫系统，由核酸酶Cas9和20bp的向导RNA(sgRNA)组成。CRISPR/Cas9的特异性切割是由sgRNA介导的，sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对，与基因组DNA上邻近有NGGprotospacer-adjacentmotif(PAM，前间区序列邻近基序)序列的位点相结合，将Cas9酶导向靶位点。这种由可编程sgRNA进行的简单目标导航，使CRISPR/Cas9系统有别于早期的技术(如锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)，这两种技术都需要复杂的DNA结合蛋白结构域的组装来进行位点特异性编辑)。Cas9需要有PAM和sgRNA结合才能在特异性位点引入双链断裂(DSB)，这种双链断裂发生在PAM上游3bp处。在大多数情况下，这些DSB通过非同源末端连接(NHEJ)途径修复，导本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB‑28突变位点的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB-28突变位点的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种载体，其包括权利要求1所述的sgRNA。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体是CRISPR/Cas9表达载体。4.一种细胞，其包括权利要求2或3所述的载体。5.一种基因编辑试剂盒，其包括权利要求1所述的sgRNA。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括供体ssDNA，所述供体ssDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。7.权利要求1所述sgRNA在用于编辑HBB-28突变位点的应用。8.一种基于CRISPR/Cas9技术编辑HBB-28突变位点的方法，其包括使用核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：包煜贤，
申请(专利权)人：广州鼓润医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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