葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法。该侵染性克隆载体是将分段扩增的葡萄浆果内坏死病毒基因组片段通过无缝克隆方式，连接至含有双35S启动子和核酶HDV‑RZ的pCB301‑2x35S‑HDVRZ‑NOS载体而获得。通过冻融法将此载体转入农杆菌EHA105感受态细胞，并通过农杆菌接种西方烟草和葡萄验证其侵染性。本发明专利技术构建的GINV侵染性克隆能够在农杆菌EHA105菌株中稳定、高效表达，并能成功侵染西方烟草和葡萄寄主。GINV侵染性克隆的获得，使得GINV的研究易于在DNA水平上操作，为后续开展GINV的生物学特性和致病性研究提供有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法。
技术介绍
1984年于日本巨峰葡萄上首次发现葡萄浆果内坏死病(最早称花叶病)，该病在日本山梨县葡萄园造成严重危害。一些敏感品种(如巨峰、先锋、立川无核、康拜尔早生)感染该病后，植株生长减弱，春季萌芽延迟，并且表现茎内坏死、短节、花叶、果粒小、果外变色和果内坏死等症状。病株摩擦接种菎诺藜后，发现了一种大小为740×12nm的线形病毒，命名为葡萄浆果内坏死病毒(Grapevineberryinnernecrosisvirus，GINV)。GINV属发状病毒属(Trichovirus)的成员之一，其基因组由3个开放阅读框组成，分别编码复制酶(RP)、移动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)。2016年，该病毒在我国葡萄上首次报道，并初步表明GINV与葡萄表现褪绿斑驳和环斑症状发生相关。对来自我国15个省(市)自治区的195个葡萄样品进行GINV检测，结果显示GINV在我国葡萄上的检出率为35.9％，在表现明显环斑症状的葡萄上的检出率为94.1％，已严重影响了我国葡萄的产量和品质。作为国内新报道的一个葡萄病毒，有必要对其致病性进行深入研究，为其危害规律及综合防控技术研究提供理论依据。开展病毒致病性研究，对于今后病毒病的防控至关重要。葡萄病毒在田间多复合侵染，因此，很难将一种葡萄病毒与某一特定的症状联系起来。对于一些新的葡萄病毒，往往通过田间症状观察、大量样品的病毒检测、病毒序列分析、嫁接传毒实验等研究，来明确病毒与田间症状的相关性。由于葡萄病毒均难纯培养，很难完成柯赫氏法则的第三条规则(即将纯培养接种到相同品种的健康植株上，出现症状相同的病害)，因此，大部分葡萄病毒与某一病害之间的关系均没有直接的证据证明。病毒侵染性克隆是病毒致病性研究的有力工具，可用于证明病毒与病害的关系，完成病毒的柯赫氏法则。病毒侵染性克隆的构建是将病毒全长cDNA片段插入到来源花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S强力启动子的下游，从而启动病毒cDNA在真核植物中转录，获得具有侵染性的病毒RNA。采用侵染性克隆接种无病毒植物，可明确病毒与植物病害之间的关系。目前，尚未发现关于构建侵染葡萄的发状病毒属病毒侵染性全长cDNA克隆的报道，且GINV与病害发生的直接关系尚未证明。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何快速、高效的构建得到葡萄浆果内坏死病毒(GINV)侵染性全长cDNA克隆。第一方面，本专利技术保护一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法。本专利技术提供的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法包括如下步骤：将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆；所述葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。上述方法中，所述植物表达载体含有35S启动子和核酶(HDV-RZ)基因。所述35S启动子用于启动所述葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的表达。所述核酶基因的作用是当重组表达载体在植物体内表达后，核酶可在合适的位置切下GINV病毒基因组。进一步的，所述35S启动子可为双35S启动子(2×35Spromoter)。更进一步的，所述植物表达载体具体可为含有双35S启动子(2×35Spromoter)和核酶基因的pCB301-2x35S-HDVRZ-NOS载体。上述方法中，将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中的方法具体如下：1)以葡萄浆果内坏死病毒的cDNA为模板，分别采用5'half1a/1b和3'half2a/2b进行PCR扩增，分别得到GINV5'扩增片段(含有序列1第1-4978位所示的DNA分子)和GINV3'扩增片段(含有序列1第4962-7229位所示的DNA分子)；2)用限制性内切酶StuI和SmaI对pCB301-2x35S-HDVRZ-NOS载体进行双酶切，得到双酶切后的载体；3)利用无缝克隆试剂盒将所述双酶切的载体与所述GINV5'扩增片段和所述GINV3'扩增片段进行连接，得到所述重组表达载体。进一步的，所述连接的条件可为50度连接1h。第二方面，本专利技术保护利用上述方法制备得到的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆。第三方面，本专利技术保护含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌。进一步的，所述重组菌为含有所述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌。更进一步的，所述农杆菌具体可为农杆菌EHA105。第四方面，本专利技术保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌的新用途。本专利技术保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一病毒为葡萄浆果内坏死病毒。本专利技术还保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒生物学特性和/或致病机理中的应用。本专利技术还保护上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆或含有上述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒与宿主植物互作中的应用。本专利技术的有益效果如下：本专利技术首次成功构建葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆，并经过PCR和病毒粒子观察，证明其可成功侵染烟草和葡萄，而且采用该侵染性全长cDNA克隆侵染葡萄，可引起明显症状，该症状与田间自然感染该病毒的贝达葡萄症状相同。本专利技术将分段扩增的葡萄浆果内坏死病毒基因组片段通过无缝克隆方式，连接至含有双35S启动子和核酶HDV-RZ的pCB301-2x35S-HDVRZ-NOS载体，得到含有GINV基因组全长cDNA的重组载体，通过冻融法将此重组载体转入农杆菌EHA105感受态细胞，并通过农杆菌接种西方烟草和葡萄验证其侵染性。通过实验证明：本专利技术构建的GINV侵染性全长cDNA克隆能够在农杆菌EHA105菌株中稳定、高效表达，并能成功侵染西方烟草和葡萄寄主。本专利技术构建的GINV侵染性全长cDNA克隆为首个侵染葡萄的发状病毒属病毒的侵染性克隆，采用该侵染性克隆对无病毒葡萄进行接种，获得GINV单一侵染葡萄的毒源材料，对进一步明确GINV的致病性具有重要理论和实践意义。同时GINV侵染性克隆的获得，也使得GINV的研究易于在DNA水平上操作，为后续开展GINV的生物学特性和致病性研究提供有力的工具。附图说明图1为GINV基因组全长cDNA的分段扩增结果。M：DNAmarkerDL5000；1：引物5'half1a/1b扩增结果；2：引物3’half2a/2b扩增结果。图2为pCB301-2x35S-HDVRZ-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法，包括如下步骤：将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1‑4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962‑7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆；所述葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法，包括如下步骤：将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆；所述葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体含有35S启动子；所述35S启动子用于启动所述葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的表达。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体含有核酶基因。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为p...

【专利技术属性】
技术研发人员：范旭东，董雅凤，张尊平，任芳，胡国君，
申请(专利权)人：中国农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21