本发明专利技术提供了一种蚯蚓中止咳祛痰抗炎抗微生物提取物的制备方法。本发明专利技术提供的提取方法主要是通过pH4.8‑5.4的NaAC缓冲液和丙酮对蚯蚓匀浆进行提取的。本发明专利技术经过反复试验，对本发明专利技术申请人之前提供的提取工艺进行了优化，大大缩短了蚯蚓提取物的制备时间，从42‑45小时缩短到了15—18个小时；并且得率从73％提高到了82％，提高了总活性的回收率，比活力从1141提高到了4443，比活力提高了3.9倍；纯化倍数从41倍提高到158倍，脱氧核糖核酸酶活性成分的纯化倍数增加近四倍。本发明专利技术提供的制备方法工艺简单、成本低、易于工业化生产推广应用。由本发明专利技术提供的制备方法制备得到的产品纯度和活性均要显著高于现有方法制备得到的相关类似产品。
【技术实现步骤摘要】
一种蚯蚓中止咳祛痰抗炎抗微生物提取物的制备方法
本专利技术属于制药领域，具体涉及一种地龙生物祛痰抗炎提取物及其制备方法。
技术介绍
蚯蚓俗称地龙，是我国传统中药材，其体内含有多种生物活性成分，具有平肝息风、清热止痉、通络、平喘、利尿的功效，在一些哮喘性疾病中常被用到。研究表明它具有降压、抗血栓、平喘、解热镇痛、抗凝、抗菌、等生物学活性免疫调节等作用。其体内存在有止咳、化痰作用的活性成分；醇提取物具有抗炎作用。申请人对蚯蚓提取物的止咳、祛痰、抗微生物、抗炎作用及其制备方法进行了研究报道，在前期报道中(见文献ZhuZ,YangQ,YuB,etal.PurificationandcharacterizationofanovelearthwormDNase.PrepBiochemBiotechnol.2015；45(4):365-79.)，蚯蚓提取物的制备方法操作比较耗时耗力，工艺冗长繁杂，得到的产物中仍然含有大量的杂质，分离效果不明显。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种提取物，所述提取物的制备方法包括：将pH4.8-5.4的缓冲液加入蚯蚓匀浆后进行提取。具体的，所述pH4.8-5.4的缓冲液包括醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；所述醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液中的离子浓度包括0.1M；再具体的，所述醋酸钠缓冲液包括0.1MNaAC缓冲液；所述0.1MNaAC缓冲液的溶质包括醋酸和醋酸钠，溶剂包括水，所述醋酸的浓度为0.1M、醋酸钠的浓度为0.1M；所述蚯蚓匀浆具体包括将蚯蚓制成匀浆；具体的，在所述制成匀浆前，还包括将蚯蚓用水洗净；所述水包括蒸馏水；所述蚯蚓包括鲜活蚯蚓；所述制成匀浆还包括在4℃下制成匀浆；具体的，所述pH4.8-5.4的缓冲液加入的体积包括等体积加入。具体的，所述提取包括提取2小时。具体的，所述提取后，还包括：1)再加入丙酮后，放置1小时，离心；所述加入的丙酮包括使丙酮的体积百分含量为15％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心15分钟；2)向步骤1)离心后所得上清中补加丙酮，放置2小时，离心；所述补加丙酮包括使丙酮的体积百分含量为50％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心15分钟；3)向步骤2)离心后所得沉淀加水溶解；所述水包括蒸馏水；所述溶解包括超声助溶；4)再加入pH8.0Tris-HCl缓冲液，使所述Tris-HCl缓冲液终浓度为0.05M，放置2小时，离心；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心10分钟；5)向步骤4)离心后所得上清中加入丙酮，放置1小时，离心所得沉淀即得。所述加入丙酮包括使丙酮的体积百分含量为50％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心10分钟；具体的，所述提取物的制备方法还包括纯化过程，所述纯化过程包括用pH4.8—5.2的缓冲液作为样品溶液和/或洗脱液。具体的，所述pH4.8-5.2的缓冲液包括醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；再具体的，所述醋酸钠缓冲液和所述磷酸盐缓冲液中的离子浓度相同；所述提取物的制备方法还包括离子交换层析和/或亲和层析：所述离子交换层析包括：1)用A液冲洗柱子后上样；(所述冲洗包括用A液平衡3-5个柱体积后上样，上样结束后，用所述A液继续冲3-5个柱体积；)2)用20％的B液做第一次洗脱，洗脱后，用30％的B液做第二次洗脱，收集30％的洗脱液；所述离子交换层析前还包括将本专利技术任一所述的提取物用A液溶解后离心，取上清用22微米的滤膜过滤后用于层析上样；所述离心包括15000g,离心10分钟；所述亲和层析包括：1)用A液冲洗柱子后上样；(所述冲洗包括用A液平衡层析柱3-5个柱体积)；2)上样结束后，用A液冲洗柱子后，再用30％的B液洗脱，洗脱液浓缩后即得。所述冲洗包括用A液平衡层析柱3-5个柱体积；所述亲和层析包括肝素亲和层析；所述亲和层析前还包括将离子交换层析所得的30％的洗脱液用A液按照体积稀释5倍后用于亲和层析上样。所述A液包括pH4.8—5.2的NaAC缓冲液，其中，所述NaAC缓冲液中NaAC、NaCl的浓度均为0.02—0.05M；优选0.02M；所述B液包括pH4.8—5.2的NaAC缓冲液，其中，所述NaAC缓冲液中NaAC的浓度为0.02—0.05M，优选0.02M；NaCl的浓度为1M；所述20％的B液、30％的B液为，将所述A液和B液混合后得混合液，B液在混合液中的体积百分含量为20％时为20％的B液，B液在混合液中的体积百分含量为30％时为30％的B液。本专利技术的还一个目的是提供一种提取物的制备方法，所述制备方法包括：将pH4.8-5.4的缓冲液加入蚯蚓匀浆后进行提取。具体的，所述pH4.8-5.4的缓冲液包括醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；所述醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液中的离子浓度包括0.1M；再具体的，所述醋酸钠缓冲液包括0.1MNaAC缓冲液；所述0.1MNaAC缓冲液的溶质包括醋酸和醋酸钠，溶剂包括水，所述醋酸的浓度为0.1M、醋酸钠的浓度为0.1M；所述蚯蚓匀浆具体包括将蚯蚓制成匀浆；具体的，在所述制成匀浆前，还包括将蚯蚓用水洗净；所述水包括蒸馏水；所述蚯蚓包括鲜活蚯蚓；所述制成匀浆还包括在4℃下制成匀浆；所述pH4.8-5.4的缓冲液加入的体积包括等体积加入；所述提取包括提取2小时。具体的，所述提取后，还包括：1)再加入丙酮后，放置1小时，离心；所述加入的丙酮包括使丙酮的体积百分含量为15％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心15分钟；2)向步骤1)离心后所得上清中补加丙酮，放置2小时，离心；所述补加丙酮包括使丙酮的体积百分含量为50％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心15分钟；3)向步骤2)离心后所得沉淀加水溶解；所述水包括蒸馏水；所述溶解包括超声助溶；4)再加入pH8.0Tris-HCl缓冲液，使所述Tris-HCl缓冲液终浓度为0.05M，放置2小时，离心；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心10分钟；5)向步骤4)离心后所得上清中加入丙酮，放置1小时，离心所得沉淀即得。所述加入丙酮包括使丙酮的体积百分含量为50％；所述丙酮为预冷丙酮；所述预冷温度包括-20℃；所述放置包括混匀后4℃放置；所述离心包括4℃，15000g,离心10分钟；具体的，所述方法还包括纯化过程，所述纯化过程包括用pH4.8—5.2的缓冲液作为样品溶液和/或洗脱液。具体的，所述pH4.8-5.2的缓冲液包括醋酸钠缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；再具体的，所述醋酸钠缓冲液和所述磷酸盐缓冲液中的离子浓度相同；具体的，所述方法还包括离子交换层析和/或亲和层析：所述离子交换层析包括：1)用A液冲洗柱子后上样；(所述冲洗包括用A液平衡3-5个柱体积后上样，上样结束后，用所述A液继续冲3-5个柱体积；)2)用20本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提取物，其特征在于，所述提取物的制备方法包括：将pH4.8‑5.4的缓冲液加入蚯蚓匀浆后进行提取。
【技术特征摘要】
1.一种提取物，其特征在于，所述提取物的制备方法包括：将pH4.8-5.4的缓冲液加入蚯蚓匀浆后进行提取。2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述提取包括提取2小时。3.根据权利要求1和/或2所述的提取物，其特征在于，所述提取后，还包括1)再加入丙酮后，放置1小时，离心；2)向步骤1)离心后所得上清中补加丙酮，放置2小时，离心；3)向步骤2)离心后所得沉淀加水溶解；4)再加入pH8.0Tris-HCl缓冲液，使所述Tris-HCl缓冲液终浓度为0.05M，放置2小时，离心；5)向步骤4)离心后所得上清中加入丙酮，放置1小时，离心所得沉淀即得。4.根据权利要求1、2和/或3任一所述的提取物，其特征在于，所述提取物的制备方法还包括纯化过程，所述纯化过程包括用pH4.8—5.2的缓冲液作为样品溶液和/或洗脱液。5.根据权利要求1、2、3和/或4任一所述的提取物，其特征在于，所述提取物的制备方法还包括离子交换层析和/或亲和层析：所述离子交换层析包括：1)用A液冲洗柱子后上样；2)用20％的B液做第一次洗脱，洗脱后，用30％的B液做第二次洗脱，收集30％的洗脱液；所述亲和层析包括：1)用A液冲洗柱子后上样；2)上样结束后，用A液冲洗柱子后，再用30％的B液洗脱，洗脱液浓缩后即得；所述A液包括pH4.8—5.2的NaAC缓冲液，其中，所述NaAC缓冲液中NaAC、NaCl的浓度均为0.02—0.05M；所述B液包括pH4.8—5.2的NaAC缓冲液，其中，所述NaAC缓冲液中NaAC的浓度为0.02—0.05M，NaCl的浓度为1M；所述20％的B液、30％的B液为，将所述A液和B液混合后得混合液，B液在混合液中的体积百分含量为20％时为20％的B液，B液在混合液中的体积百分含量为30％时为30％的B液。6.一种提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将pH4.8-5.4的缓冲液加入蚯蚓匀浆后进行提取。7...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱智强，牛勃，孙春荣，王秀伟，官臻，
申请(专利权)人：首都儿科研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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