一种乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法。根据GenBank公布的乙肝病毒DNA的C基因区域的保守序列设计引物，建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒和进行阴阳性判断的方法。本发明专利技术的方法具有灵敏度高，重复性好，特异性强，成本低廉，耗时短，检测准确等优点。

Detection of hepatitis B virus by SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

The invention establishes a fast method for detecting hepatitis B virus DNA by SYBR Green I fluorescent quantitative PCR. Primers were designed according to the conservative sequence of C gene region of hepatitis B virus DNA published by GenBank, and SYBR Green I fluorescence quantitative PCR was established to detect hepatitis B virus and to make negative and positive judgments. The method of the invention has the advantages of high sensitivity, good repeatability, strong specificity, low cost, short time consumption and accurate detection.

【技术实现步骤摘要】
一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法
本专利技术具体涉及一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，属于生物

技术介绍
乙肝病毒感染是引起急、慢性肝脏疾病的主要原因。全球约有30%的人口，即20亿人曾感染过乙肝病毒，约有3.5亿慢性HBV感染者正面临着发展为致死性肝病的风险，每年约有100万慢性乙肝感染者死于肝硬化和肝癌。在己知的人类致癌因子中，乙肝病毒仅次于烟草位居第二。而我国作为肝炎大国，约50%一70%的人群受过乙肝病毒感染，8%-12%的人群为乙肝病毒表面抗原携带者。目前，乙型肝炎病毒的诊断主要依赖于酶联免疫吸附技术和PCR检测技术。近年来实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)以其快速、简便、特异度强、灵敏度高等一系列优点在病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用。根据荧光染料标记形式的不同，可分为非特异性扩增-双链DNA嵌入荧光染料、特异扩增的荧光标记引物和特异扩增的荧光标记探针三大类，但是荧光标记引物或探针法成本较为昂贵，不利于大量临床标本的开展。本专利技术采取SYBRGreenⅠ染料法，无需设计探针，成本低廉，实验设计简单，可同时进行熔解曲线分析评价扩增反应的特异性，为乙型肝炎病毒的早期定量诊断提供依据，对乙型肝炎临床诊断、疗效观察和预防具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的技术任务在于提供一种精确、简便的用于定量乙肝病毒血清DNA的方法。本专利技术的一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，根据GenBank公布的乙肝病毒DNA的C基因区域的保守序列设计引物，建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒和进行阴阳性判断的方法，实现了对乙肝病毒的定量检测。所述的一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、根据乙肝病毒DNA的C基因区域的保守序列设计引物依据HBVC基因序列，通过DNAMAN软件进行序列比对，确定C基因特异序列区，在该区域设计特异性针对C基因的荧光定量引物序列如下：上游引物HBVC-F，序列为：SEQIDNO.1下游引物HBVC-R，序列为：SEQIDNO.2二、标准曲线的构建依据步骤一设计的引物，以XRV全长Sl基因cDNA为模板，进行荧光定量扩增，绘制荧光定量标准曲线三、实验结果判定标准若阴性对照品无Ct值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照品Ct值应小于35.0，扩增曲线典型，待测样品的Ct值小于35.0，并且出现典型的扩增曲线，判断为阳性，待测样品无Ct值或者大于35并且无规则扩增曲线，判断为阴性。进一步地，所述的一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的阳性对照品为包含HBV基因组的pBS-HBV-3.6Ⅱ质粒。进一步地，所述的一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的阴性对照品为PBS溶液。进一步地，所述的一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于荧光定量PCR的反应体系为20μL，具体成分为：PowerUpSYBRGreenMasterMIX10μL，HBVC-F0.8μL，HBVC-R0.8μL，模板1μL，无核酸酶水7.4μL。进一步地，所述的一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于荧光定量PCR的反应程序为：50℃30s，95℃30s，(95℃15s，60℃30s)×40循环，60℃采集荧光信号。以下结合具体实例和附图说明对本专利技术做进一步的说明。附图说明图1根据HBVC基因设计的三对引物扩增阳性对照品产物琼脂糖凝胶电泳图（M：DL2000DNAMarker；CK-：阴性对照样本；1-5分别为不同的引物对）；图2乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法标准曲线制作。以1×103～1×108copies/mL6个梯度标准品进行荧光定量PCR扩增。(A)荧光定量PCR最终得到的扩增曲线；(B)不同终浓度HBVDNA质粒经过检测后的Ct值；(C)利用浓度和Ct值构建的标准曲线；图3乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法重复性验证。分别以1×105～1×106copies/mL3个浓度分别进行3次平行实验。得到荧光定量PCR最终得到的扩增曲线；图4乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法特异性验证扩增曲线。具体实施例【实施例1】靶标选择、引物设计及筛选(1)靶标选择及引物设计：利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast网站查找的来源于中国的HBVC基因序列，并通过DNAMAN软件进行序列比对，找出C基因范围内的保守区域，设计引物，引物序列如下所示；表1HBV引物对及扩增长度（2）引物筛选以pBS-HBV-3.6Ⅱ质粒为模板，使用不同引物对进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率。筛选出最佳引物对用于后续的实验；PCR扩增体系为20μL，具体成分为：LATaqMIX10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL，无核酸酶水7μL；PCR的反应程序为：95℃2min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)×32循环，72℃10min，16℃保存。【实施例2】乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法标准曲线制作（1）标准品制作以pBS-HBV-3.6Ⅱ质粒制作HBV检测标准品，使用NanoDropLite分光光度计计算质粒浓度，并计算拷贝数，拷贝数计算公式为：(6.02×1023)×(g/ml)/(DNAlength×660)=copies/ml。以10倍的梯度稀释阳性对照质粒，稀释为103～108copies/ml6个稀释梯度制作标准曲线；（2）标准曲线制作以1×103～1×108copies/mL6个梯度标准品进行荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线，及以初始浓度拷贝数的对数为x轴、Ct值为y轴的标准曲线，标准曲线方程为y=3.3521x+14.563，相关系数R²=0.9985。【实施例3】乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法重复性验证选取重组质粒标准品分别以1×105～1×107copies/mL3个浓度，用来评估SYBRGreenⅠ荧光定量PCR的重复性。每个浓度进行3个平行实验管间的Ct值。结果显示，同一次实验内3个平行管的Ct值基本上重合，表明体系重复性好。【实施例4】乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法特异性验证特异性试验：以乙型肝炎病毒的重组质粒作为阳性对照，阴性对照，柯萨奇病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I和II等相病毒作特异对照，进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的特异性试验。乙型肝炎病毒被特异性扩增，阴性对照和无关病毒株均未被扩增，并且无非特异性扩增条带，表明特异度为100%。序列表<110>重庆高圣生物医药有限责任公司<120>一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法<160>7<170&a本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、根据乙肝病毒DNA的C基因区域的保守序列设计引物依据HBV C基因序列，通过DNAMAN软件进行序列比对，确定C基因特异序列区，在该区域设计特异性针对C的荧光定量引物序列如下：上游引物HBVC‑F，序列为：SEQ ID NO.1下游引物HBVC‑R，序列为：SEQ ID NO.2二、标准曲线的构建依据步骤一设计的引物，以 XRV 全长 Sl 基因 cDNA 为模板，进行荧光定量扩增，绘制荧光定量标准曲线三、实验结果判定标准若阴性对照品无 Ct 值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照品 Ct 值应小于35.0 ，扩增曲线典型，待测样品的 Ct 值小于35.0 ，并且出现典型的扩增曲线，判断为阳性，待测样品无 Ct 值或者大于35并且无规则扩增曲线，判断为阴性。

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、根据乙肝病毒DNA的C基因区域的保守序列设计引物依据HBVC基因序列，通过DNAMAN软件进行序列比对，确定C基因特异序列区，在该区域设计特异性针对C的荧光定量引物序列如下：上游引物HBVC-F，序列为：SEQIDNO.1下游引物HBVC-R，序列为：SEQIDNO.2二、标准曲线的构建依据步骤一设计的引物，以XRV全长Sl基因cDNA为模板，进行荧光定量扩增，绘制荧光定量标准曲线三、实验结果判定标准若阴性对照品无Ct值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照品Ct值应小于35.0，扩增曲线典型，待测样品的Ct值小于35.0，并且出现典型的扩增曲线，判断为阳性，待测样品无Ct值或者大于35并且无规则扩增曲线，判断为阴性。2.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，项周，
申请(专利权)人：重庆高圣生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50