鉴定混合肉样中猪肉成分比例的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种鉴定混合肉样中猪肉成分比例的方法，以及该鉴定方法所使用的双重荧光PCR试剂盒。该试剂盒采用同源加尾系统建立的双重荧光PCR定量鉴定畜禽混合肉样中猪成分的方法具有快速、稳定、特异、灵敏和低成本的特点。由于引进了同源加尾系统，保证了即使样品中两种成份的浓度差异很大时也仍然能够真实反应其真实差异。当模拟混合样品中猪源性成分仅占1‰时，鉴定结果的相对误差仍能控制在10％以内，其精确度足以为食品流通领域的监管和企业的品控检测提供技术参考。

Method and Kit for Identification of Pork Component Proportion in Mixed Meat Samples

The invention provides a method for identifying the proportion of pork ingredients in mixed meat samples and a double fluorescent PCR kit used for the identification method.* The method is a rapid, stable, specific, sensitive and low-cost method for the quantitative identification of pig ingredients in mixed meat samples using the double fluorescent PCR established by the homologous tail tail system. The introduction of the homologous tailing system ensures that the real difference between the two components can be reflected even when the concentration of the two components in the sample is very different. When the pig derived components in simulated mixed samples accounted for only 1 per thousand, the relative error of the identification results could still be controlled within 10%, and the accuracy was enough to provide technical reference for the regulation of food circulation and the quality control of enterprises.

【技术实现步骤摘要】
鉴定混合肉样中猪肉成分比例的方法及试剂盒
本专利技术属于食品安全检测

技术介绍
牛羊肉是常见的掺假食品，而猪肉是最常见的掺假原料，主要原因是牛羊肉营养丰富，售价普遍是猪肉的4至5倍，利润空间巨大。消费者对肉品多使用观肉色、看纹理、火烧等方法对其进行简单判断，这种经验主义的判断方法对于加工食品显然难度较大。除使用猪肉对生鲜肉和肉制品进行掺假外，预包装食品虚标牛肉、猪肉等不同肉品比例的情况也十分常见，不仅侵犯消费者的权益、违背民众的宗教信仰，还容易引起法律纠纷甚至引发人畜共患病。特殊情况是，食品在加工过程中未有意掺入猪肉，但由于加工过程中沾染或使用了含有猪源性成分的调料、添加剂，导致样品中含有极微量的猪源性成分。以上不同情况的生产者出发点不同，对消费者利益造成的损害也不同，在需要对生产者进行处罚的时候，就需要综合考虑这些因素。因此，建立一种能鉴定混合肉样中猪源性成分并判定其所占比例的方法，对于支撑执法具有重要意义。目前国内外鉴定动物源性成分主要使用显微镜法、红外光谱法、ELISA法、分子生物学(包括PCR、荧光PCR、数字PCR)法等，其中分子生物学方法因特异性强、灵敏度高已逐步取代传统方法成为鉴定动物源性成分的标杆。在分子生物学检测中，PCR法的凝胶电泳条带亮度分析是一种传统意义上的半定量分析，分析结果误差范围大，无法满足本研究中混合肉样的猪源性成分定量分析要求；数字PCR法是近年来兴起的绝对定量检测方法，在定量检测中具有里程碑式的重要意义，然而，数字PCR检测成本很高，且检测过程中需要制作油包水微滴，每个微滴的拷贝数为1万至2万，等同于在每个微滴中进行一个荧光PCR反应，若样品中DNA的拷贝数远远大于2万，则定量的准确性将大打折扣，为确保定量的准确性，实际检测过程中需使用紫外分光光度计对样品DNA进行分析，并将DNA进行稀释(以确保拷贝数小于2万)，该过程容易使DNA形成气溶胶，污染实验环境，影响后续的检测工作。荧光PCR法的原理与数字PCR法相同，特异性、灵敏度和稳定性相当，但检测成本低，是目前应用最广泛的分子生物学检测技术。现有的动物源性成分荧光PCR检测方法多数以线粒体DNA(mitochondrionDNA，mtDNA)为检测目标，但不同动物的相同组织和相同动物的不同组织中线粒体数量差异较大，不宜用于定量检测。多重荧光PCR是一把双刃剑，与普通的荧光PCR相比，它能通过同一反应扩增若干靶序列，在节省试剂和时间的同时，其荧光曲线具备一定的直接比对意义。但由于引物数量多，引物间存在的竞争性，多重荧光PCR也容易形成引物二聚体，产生非特异性扩增，甚至降低扩增效率。一套完整而高效的双重荧光PCR反应体系并非各种引物、探针的简单组合。在很多实例中，各组引物、探针分别进行荧光PCR扩增均能获得预期结果，但由于各组引物、探针和各个靶序列之间的相互影响，将它们直接整合为多重荧光PCR反应后往往效果不佳。因此，需在设计上充分考虑不同靶序列、引物序列、探针序列的特性，合理使用简并碱基、同源加尾等技术，并随时优化各项实验参数。
技术实现思路
由于动物细胞核基因组中的管家基因(house-keepinggene)拷贝数稳定、变异少，不易发生核外重组，不易受异源基因的影响，能够满足定量检测的基本要求，因此可以就其设计一种使用双重荧光PCR法鉴定混合肉样中猪源性成分所占比例。具体为：一种鉴定混合肉样中猪肉成分比例的方法，通过基于同源加尾系统的双重荧光PCR同时检测畜禽基因组中普遍存在的管家基因MyostatinPrecursorMSTNmRNA基因序列和家猪基因组Susscrofabetaactin基因序列。为实现上述鉴定方法，本专利技术还提供了一种鉴定混合肉样中猪肉成分比例的试剂盒，试剂盒内的反应体系包括以下引物和探针：其中，所述荧光探针My75P的5’端标记报告荧光基团Cy5，3’端标记淬灭荧光基团BHQ3；所述荧光探针Sus91P的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。进一步，所述反应体系还包括DNA模板和DEPC水。该试剂盒的反应体系共12.5μL，具体包括：浓度分别为2μmol/L、2μmol/L、10μmol/L的引物My75TF、引物My75TR、荧光探针My75P各1μL，浓度分别为2μmol/L、2μmol/L、6μmol/L的引物Sus91TF、引物Sus91TR、荧光探针Sus91P，浓度为20μmol/L的同源加尾TagP201μL，DNA模版3μL，DEPC水2.5μL。进一步，所述反应体系的参数为：95℃3min；95℃15s，56℃45s，40个循环。有益效果：本专利技术采用同源加尾系统建立的双重荧光PCR定量鉴定畜禽混合肉样中猪成分的方法具有快速、稳定、特异、灵敏和低成本的特点。由于引进了同源加尾系统，保证了即使样品中两种成份的浓度差异很大时也仍然能够真实反应其真实差异。当模拟混合样品中猪源性成分仅占1‰时，鉴定结果的相对误差仍能控制在10％以内，其精确度足以为食品流通领域的监管和企业的品控检测提供技术参考。附图说明图1为实施例1检测畜禽源性成分的引物、探针对畜禽样品的检测结果图；其中，1为猪、2为牛、3为鸡、4为鹌鹑、5为鸭、6为鹅、7为牛、8为羊、9为马、10为驴、11为狗、12为兔、13为狐狸、14为鸽、15为骡，16为阴性对照。图2为实施例1检测畜禽源性成分的引物、探针对非畜禽样品的检测结果图；其中，1为阳性对照，2～13分别为非洲鲫鱼、鲫鱼、太阳鱼、鳙鱼、龙头鱼、鲩鱼、带鱼、鲈鱼、秋刀鱼、沙丁鱼和白鲳鱼。图3为实施例1检测猪源性成分的引物、探针对畜禽样品的检测结果图；其中，1为猪，2～15分别为：牛、鸡、鹌鹑、鸭、鹅、牛、羊、马、驴、狗、兔、狐狸、鸽和骡，16为阴性对照。图4为实施例1检测猪源性成分的引物、探针对畜禽样品的检测结果图；其中，1为阳性对照，2～13分别为非洲鲫鱼、鲫鱼、太阳鱼、鳙鱼、龙头鱼、鲩鱼、带鱼、鲈鱼、秋刀鱼、沙丁鱼和白鲳鱼。图5为实施例2所述的PCR扩增效率验证结果图；其中，1和2为猪样品2，3和4为猪样品1，5和6为阴性对照。图6为实施例3所述试剂盒对不同混合比例肉样的双重荧光PCR扩增结果图。其中，1和2为纯猪肉样品，3和10为猪牛比例1:999的样品，4和9为猪牛比例1：99的样品，5和8为猪牛比例1:9的样品，6和7为猪牛比例1:1的样品。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ，RussellDW，JanssenK，ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：引物、探针通用性试验1.材料的选取1.1畜禽样品：采购畜禽肉样品15份，使用标准方法(ZH2006-1，CNAS认可标准)扩增并测序，确其来源分别是猪、牛、鸡、鹌鹑、鸭、鹅、牛、羊、马、驴、狗、兔、狐狸、鸽、骡。1.2非畜禽样品：采购非畜禽鲜肉样品11份，使用上述1.1的标准方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定混合肉样中猪肉成分比例的方法，其特征在于，通过基于同源加尾系统的双重荧光PCR同时检测畜禽基因组中普遍存在的管家基因Myostatin Precursor MSTN mRNA基因序列和家猪基因组Sus scrofabeta actin基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定混合肉样中猪肉成分比例的方法，其特征在于，通过基于同源加尾系统的双重荧光PCR同时检测畜禽基因组中普遍存在的管家基因MyostatinPrecursorMSTNmRNA基因序列和家猪基因组Susscrofabetaactin基因序列。2.一种鉴定混合肉样中猪肉成分比例的试剂盒，其特征在于，试剂盒内的反应体系包括序列如SEQID№：1至SEQID№：6所示的引物和探针，其中序列SEQID№：1和SEQID№：2分别为检测畜禽源性成分的引物My75TF和引物My75TR，序列SEQID№：3为检测畜禽源性成分的荧光探针My75P，序列SEQID№：4和SEQID№：5分别为检测猪源性成分的引物Sus91TF和引物Sus91TR，序列SEQID№：6为检测猪源性成分的荧光探针Sus91P，还包括如序列表SEQID№：7所述的同源加尾TagP20。3.根据权利要求2所述的鉴定混合肉样中猪肉成分比例的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针My75P的5’端标记报告荧光基团Cy5，3’端标...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵建宏，罗宝正，廖秀云，赵福振，薄清如，冯家望，姚丽锋，王珊，丁琦，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44