一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种人的N‑乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其应用，将若干肿瘤患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的N‑乙酰神经氨酸裂合酶的突变蛋白，根据该人的N‑乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为肿瘤的基因诊断提供指引作用，为实现肿瘤的诊断和治疗提供科学基础。

A Human N-Acetylneuraminic Lyase Mutant Protein and Its Application

The present invention relates to a mutant protein of human N_acetylneuraminic cleavage synthase and its application. Several cancer patients are taken as research cases, and the mutation protein of human N_acetylneuraminic cleavage synthase is determined by gene detection and analysis. According to the mutant protein of human N_acetylneuraminic cleavage synthase, gene chip, monoclonal antibody and ELISA kit are prepared. Gene diagnosis of tumors provides guidance and scientific basis for the diagnosis and treatment of tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其应用
本专利技术涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其应用。
技术介绍
N-乙酰神经氨酸裂合酶(N-acetylneuraminatelyase)是裂解酶的一种，在一定条件下，该酶可以将N-乙酰神经氨酸裂解成N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸，又能催化ManNAc和Pyr羟醛缩合生成N-乙酰神经氨酸。N-乙酰神经氨酸裂合酶，是唾液酶代谢的末端酶。该酶在高等动物及一些微生物中都有存在。在动物体内，该酶主要是控制唾液酸的循环。唾液酸的含量测定对多种疾病的诊断、治疗具有重要意义，例如肿瘤。因此，对人的N-乙酰神经氨酸裂合酶的检测和研究，可以对肿瘤的检测和治疗起到积极作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其应用。本专利技术技术方案包括：第一方面，提供一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。第二方面，提供一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶的突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。第三方面，提供一种基因芯片，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据上述所述人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的核苷酸序列，与人的N-乙酰神经氨酸裂合酶正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。优选地，所述核苷酸探针为SEQIDNO:3所示的碱基序列；所述核苷酸探针为SEQIDNO:4所示的碱基序列；所述核苷酸探针为SEQIDNO:5所示的碱基序列。第四方面，提供一种试剂，所述试剂中含有用于检测上述人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的引物对。优选地，所述引物对包括下述任一上游引物与下述任一下游引物的组合：上游引物为如SEQIDNO:8～NO:10中任一所示的碱基序列；下游引物为如SEQIDNO:11～NO:31中任一所示的碱基序列。第五方面，提供一种特异性识别人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的单克隆抗体，由上述的试剂制备而成，其可与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列特异性结合。第六方面，提供一种用于检测人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。优选地，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。本专利技术提供了一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其应用，将若干肿瘤患者作为研究病例，对病例进行基因检测并分析，确定出人的N-乙酰神经氨酸裂合酶的突变蛋白，根据该人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为肿瘤的基因诊断提供指引作用，为实现肿瘤的诊断和治疗提供科学基础。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术实施例一提供的一种比对结果示意图；图2是本专利技术实施例一提供的一种基因芯片布局图；图3是本专利技术实施例二提供的一种显色结果示意图；图4是本专利技术实施例二提供的另一种显色结果示意图；图5是本专利技术实施例五提供的一种蛋白含量的标准曲线；图6是本专利技术实施例五提供的一种Westernblot检测结果示意图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一、基因芯片的制备首先，可以根据申请号为“201710429915.8”、专利名称为“一种突变蛋白的检测方法及装置”的中国专利技术专利中描述的检测方法，确定出人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；相应地，根据该编码基因确定出人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。其次，根据人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白及其编码基因，按照如下方式实现基因芯片的制备。1、核苷酸探针的设计(1)核苷酸探针的设计：核苷酸探针根据人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的核苷酸序列，与人的N-乙酰神经氨酸裂合酶正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确定，并根据如下探针的设计原则，设计出针对人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的特异性的核苷酸探针。其中，核苷酸探针设计的原则如下：①核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值，上下波动5℃；②核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过4个；③G+C含量为40％-60％，减少非特异性杂交保证杂交的特异性；④核苷酸探针序列中与探针分子内部稳定二级结构配对的碱基长度应少于4bp，这样可以保证不会因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影响杂交效率；⑤经同源比较与其他序列的相似性小于40％；⑥经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。其中，人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白对应的氨基酸序列与人的N-乙酰神经氨酸裂合酶正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1，其中，图1中的Query序列是人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白对应的氨基酸序列，Sbjct序列是人的N-乙酰神经氨酸裂合酶正常蛋白对应的氨基酸序列，Query序列与Sbjct序列之间的序列为比对结果，根据图1可知，人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白相对于人的N-乙酰神经氨酸裂合酶正常蛋白，在若干位置处发生了插入，根据SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，以及图1的比对结果，为了能够特异性识别待检测对象的N-乙酰神经氨酸裂合酶是否发生了突变，那么在选取核苷酸探针时，可以按照如下几种方式中的任一种方式设计核苷酸探针：①选取插入位置的插入核苷酸序列生成核苷酸探针；②在插入位置之前，和/或，在插入位置之后，各选择若干个核苷酸序列，将选择的若干个序列核苷酸与插入位置的插入核苷酸序列共同生成核苷酸探针，其中，生成的核苷酸探针中相邻核苷酸的先后顺序与其在突变蛋白对应的核苷酸序列中的顺序一致；③在插入位置之前选择若干个核苷酸序列，与在插入位置的开始位置处选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；④在插入位置之后选择若干个核苷酸序列，与在插入位置的结束位置处选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针。在本实施例中，根据SEQIDNO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设计原则，按照上述方式至少可以设计出如下几种优选地核苷酸探针：如SEQIDNO:3所示，该核苷酸探针为：atggctatgt；如SEQIDNO:4所示，该核苷酸探针为：ggctatgtga；如SEQIDNO:5所示，该核苷酸探针为：gctagaaagag。(2)核苷酸探针的合成：通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。2、检测人的N-乙酰神经氨酸裂合酶是否发生突变的基因芯片的制备为了保证检测对象样品的质量，还需在基因芯片上设计空白对照、阳性对照和阴性对照。其中，该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。在图2中，□为空白对照，○为阴性对照，为阳性对照，为实验组。其中，实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。对于空白对照、阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、以及阳性对照所需点样的阳性内参质控探针设计如下：空白对照：是不含任何基因片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人的N‑乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种基因芯片，其特征在于，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据权利要求2所述人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的核苷酸序列，与人的N-乙酰神经氨酸裂合酶正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸探针为SEQIDNO:3所示的碱基序列；所述核苷酸探针为SEQIDNO:4所示的碱基序列；所述核苷酸探针为SEQIDNO:5所示的碱基序列。5.一种试剂，其特征在于，所述试剂中含有用于检测权利要求1所述人的N-乙酰神经氨酸裂合酶突变蛋白的引物对。6.根据权利要求5所述的试剂，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，吴玉乾，冯建华，李冬梅，张树军，陈玉皎，王文雅，
申请(专利权)人：天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12