一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法技术

本发明专利技术涉及生物制品及分离技术领域，特别公开了一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法。该提取方法通过水稀释法初步提取后，利用阴离子交换层析、嗜硫亲和层析（或疏水层析）两步组合，经除盐浓缩、浓缩液冷藏或冻干成粉，最终获得高品质的IGY抗体成品。本发明专利技术步骤简单，产品纯度好，收率高，最大程度保证了产品的安全性，并且克服了传统盐析、聚乙二醇沉淀法及采用单一阴离子交换层析法的缺陷，可有效解决成本高、废液处理难的问题，适合工业化生产应用。

Extraction of yolk antibody against Helicobacter pylori

The invention relates to the field of biological products and separation technology, in particular to a method for extracting yolk antibody of Helicobacter pylori. After preliminary extraction by water dilution method, high quality IGY antibody products were obtained by two steps of anion exchange chromatography, sulfur affinity chromatography (or hydrophobic chromatography), desalination and concentration, refrigeration or freeze-drying. The method has the advantages of simple steps, good product purity, high yield, maximum product safety, and overcomes the defects of traditional salting-out, polyethylene glycol precipitation and single anion exchange chromatography. It can effectively solve the problems of high cost and difficult waste liquid treatment, and is suitable for industrial production and application.

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法（一）
本专利技术涉及生物制品及分离
，特别涉及一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法。（二）
技术介绍
幽门螺杆菌（HP）是唯一能够在人类胃部生长存活的微生物，通过口口、粪口、食物等方式进行传播，侵入人体后定植在胃底和十二指肠黏膜上皮组织表面。目前我国有50%以上的人口呈幽门螺杆菌阳性，幽门螺旋杆菌感染是导致胃炎和胃溃疡的主要因素，并且已经被世界卫生组织列为胃癌的第一类致癌因子。目前根除幽门螺旋杆菌的治疗方案为抗生素三联疗法或四联疗法，由于耐药性逐渐增大，因此急需新的替代疗法。随着科技发展及免疫疗法的深入探究，抗体治疗幽门螺杆菌的方法越来越受关注。幽门螺杆菌感染母鸡后，母鸡的免疫系统产生抗体消除抗原，获得的抗体在输卵管内血液中被选择性地传递到卵黄中，成为卵黄中唯一的免疫球蛋白类物质，即IGY抗体。IGY抗体具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力，对胃蛋白酶有较高的抵抗力，在PH4.0，温育1h，能保持91%的活性；IGY抗体对哺乳动物亲和性高，使用安全性好，而且可以针对幽门螺旋杆菌的多个毒力因子发挥抗体作用，克服了单克隆抗体抑制幽门螺杆菌的针对性单一¸疗效不明显的缺陷。抗体在卵黄原料中含量很低，一般需要提取出纯品进行使用，可用于幽门螺旋杆菌的研究、检测、诊断和治疗。目前专利及文献中一般采用聚乙二醇沉淀、离子交换层析、盐析等方法，不仅纯度差、收率低，而且污染环境较严重。（三）
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种产品纯度好、回收率高、污染少的幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法，以含有幽门螺旋杆菌卵黄抗体的鸡蛋为处理对象，包括如下步骤：（1）将鸡蛋清洗后浸泡体积浓度为75%的乙醇溶液中消毒30min；（2）收集鸡蛋的卵黄，用4-9倍体积的纯化水稀释，室温下搅拌30min，调整pH为4.5-5.5，于2-6℃下冷藏10-24h，离心卵黄溶液，收集上清液；（3）将上清液调整为pH5.0-8.0、0.02M的磷酸盐缓冲液，利用弱碱性阴离子填料吸附，吸附量为60-100mg/mL，流速为3BV/h，吸附完毕后，用2-4BV体积、pH5.0-8.0、0.02M的磷酸盐缓冲液冲洗；（4）用氯化钠溶液进行线性洗脱，收集部分洗脱液；（5）将收集的洗脱液用盐溶液调整为1-0.8M浓度，同时调节pH值为6.0-8.0，利用层析填料进行吸附，蛋白吸附量为20-30mg/mL，流速为3BV/h，吸附完毕后用2-3BV、1-0.8M的盐溶液冲洗，冲洗体积为2-3BV；（6）利用盐溶液进行层析线性洗脱，收集部分洗脱液；（7）用1000-100000Da的超滤膜对洗脱液进行脱盐浓缩，中间加去离子水3-5次，至导电率小于30us/cm，浓缩液冷藏或冻干成粉，即得产品。本专利技术通过水稀释法初步提取后，利用阴离子交换层析、嗜硫亲和层析（或疏水层析）两步组合，经除盐浓缩、浓缩液冷藏或冻干成粉，最终获得高品质的IGY抗体成品，产品纯度好，收率高，满足大生产需要。本专利技术的更优技术方案为：所述含有幽门螺旋杆菌卵黄抗体的鸡蛋为CagA阳性幽门螺旋杆菌抗原免疫蛋鸡所产的鸡蛋。步骤（2）中，卵黄溶液在8000-10000rpm/min、6℃条件下离心30min，收集上清液步骤（3）中，上柱前的上清液调整为pH6.5、0.02M的磷酸盐缓冲液，弱碱性阴离子填料为DEAE填料或琼脂糖凝胶，优选琼脂糖凝胶。步骤（4）中，氯化钠溶液的线性洗脱浓度为0-1M，总洗脱体积为40-60BV，收集的洗脱段为0.05-0.3M。步骤（5）中，层析填料为嗜硫亲和层析填料或疏水层析填料，嗜硫亲和层析填料功能基团为2-巯基吡啶，疏水层析填料的功能基团为苯基、短链烷基、烷氨基、聚乙二醇和聚醚中的一种，优选烷氨基或聚乙二醇。步骤（5）和（6）中，盐溶液为硫酸铵、硫酸钠和氯化钠溶液中的一种，优选硫酸铵溶液；盐溶液的层析线性洗脱浓度为0-1M，洗脱总体积为8BV，嗜硫亲和层析填料的收集洗脱段为0.4-0.02M，疏水层析填料的收集洗脱段为0.4-0.08M。本专利技术产品IGY抗体通过SDS-PAGE电泳进行检测，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，低电压80V，高电压120V，考马斯亮蓝法染色。IGY抗体纯度检测利用quantityone软件对电泳图进行扫描¸分析和计算。本专利技术提供的技术方案步骤简单，产品纯度好，收率高，最大程度保证了产品的安全性，并且克服了传统盐析、聚乙二醇沉淀法及采用单一阴离子交换层析法的缺陷，可有效解决成本高、废液处理难的问题，适合工业化生产应用；提取的IGY抗体可以广泛应用于医疗、食品、饲料等领域中，对预防以及辅助治疗幽门螺旋杆菌感染有积极的效果。（四）附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1为本专利技术离子交换层析纯化后的SDS-PAGE电泳图；图2为本专利技术嗜硫亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳图；图3为本专利技术疏水层析纯化后的SDS-PAGE电泳图。（五）具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做详细阐述，利于本领域的工作者深入理解本专利技术，而不构成对其权利的限制。实施例1：一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法，初步提取方法包括如下步骤：（1）取40个经过HP抗原免疫后蛋鸡所产鸡蛋，用清水清洗后浸泡在75%乙醇溶液消毒30min，清水冲洗后，利用蛋黄分离器分离去除蛋清；（2）将整个完整蛋黄轻轻放在表面光滑的滤纸上进行滚动，有利于去除卵黄表面的残余蛋清，收集卵黄体积605ml，IGY含量为11.55mg/ml；（3）用纯化水稀释卵黄至6000ml，室温下搅拌30min，然后利用0.2M盐酸缓慢调整pH为5.0，4℃放置12h；（4）卵黄溶液用高速离心机以8000rpm/min离心30min,收集上清液共5621ml，蛋白总含量为2.51mg/ml，IGY含量为1.22mg/ml。本实施例收率98.1%。实施例2：一种幽门螺旋杆菌IGY抗体的提取方法，离子交换层析提取方法包括如下步骤：（1）将实施例1中步骤（4）所得到的上清液，用磷酸盐调整为PH6.5、0.02M的缓冲液；（2）用θ22×400的树脂柱吸附，填料为琼脂糖凝胶100ml，上样流速为3BV/h；（3）上样完毕，用PH6.5、0.02M的磷酸盐缓冲液冲洗3BV，流速为3BV/h。过柱液体积共5819ml，蛋白含量1.09mg/ml，IGY未检出；（4）用氯化钠溶液进行线性洗脱，浓度范围0-1M，洗脱液总体积5200ml,检测点为0.02M、0.05M、0.1M、0.3M、1M，收集0.05-0.3M洗脱段的洗脱液1224ml，洗脱液蛋白含量5.75mg/ml；（5）用quantityone软件分析，IGY纯度为88.9%，IGY含量为5.11mg/ml。本实施例提取收率91.2%。洗脱液电泳图，见附图1。实施例3：一种幽门螺旋杆菌IGY抗体的提取方法，嗜硫亲和层析提取方法包括如下步骤：（1）实施例2中步骤（4）的洗脱液600ml，用硫酸铵调整浓度为0.8M，用氢氧化钠溶液调整pH为8.0；（2）用θ30×400的树脂柱进行吸附，填料为嗜硫亲和填料150ml，功能基团为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法，以含有幽门螺旋杆菌卵黄抗体的鸡蛋为处理对象，其特征为，包括如下步骤：（1）将鸡蛋清洗后浸泡体积浓度为75%的乙醇溶液中消毒30min；（2）收集鸡蛋的卵黄，用4‑9倍体积的纯化水稀释，室温下搅拌30min，调整pH为4.5‑5.5，于2‑6℃下冷藏10‑24h，离心卵黄溶液，收集上清液；（3）将上清液调整为pH 5.0‑8.0、0.02M的磷酸盐缓冲液，利用弱碱性阴离子填料吸附，吸附量为60‑100mg/mL，流速为3BV/h，吸附完毕后，用2‑4BV体积、pH5.0‑8.0、0.02M的磷酸盐缓冲液冲洗；（4）用氯化钠溶液进行线性洗脱，收集部分洗脱液；（5）将收集的洗脱液用盐溶液调整为1‑0.8M浓度，同时调节pH值为6.0‑8.0，利用层析填料进行吸附，蛋白吸附量为20‑30mg/mL，流速为3BV/h，吸附完毕后用2‑3BV、1‑0.8M的盐溶液冲洗，冲洗体积为2‑3BV；（6）利用盐溶液进行层析线性洗脱，收集部分洗脱液；（7）用1000‑100000Da的超滤膜对洗脱液进行脱盐浓缩，中间加去离子水3‑5次，至导电率小于30us/cm，浓缩液冷藏或冻干成粉，即得产品。...

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法，以含有幽门螺旋杆菌卵黄抗体的鸡蛋为处理对象，其特征为，包括如下步骤：（1）将鸡蛋清洗后浸泡体积浓度为75%的乙醇溶液中消毒30min；（2）收集鸡蛋的卵黄，用4-9倍体积的纯化水稀释，室温下搅拌30min，调整pH为4.5-5.5，于2-6℃下冷藏10-24h，离心卵黄溶液，收集上清液；（3）将上清液调整为pH5.0-8.0、0.02M的磷酸盐缓冲液，利用弱碱性阴离子填料吸附，吸附量为60-100mg/mL，流速为3BV/h，吸附完毕后，用2-4BV体积、pH5.0-8.0、0.02M的磷酸盐缓冲液冲洗；（4）用氯化钠溶液进行线性洗脱，收集部分洗脱液；（5）将收集的洗脱液用盐溶液调整为1-0.8M浓度，同时调节pH值为6.0-8.0，利用层析填料进行吸附，蛋白吸附量为20-30mg/mL，流速为3BV/h，吸附完毕后用2-3BV、1-0.8M的盐溶液冲洗，冲洗体积为2-3BV；（6）利用盐溶液进行层析线性洗脱，收集部分洗脱液；（7）用1000-100000Da的超滤膜对洗脱液进行脱盐浓缩，中间加去离子水3-5次，至导电率小于30us/cm，浓缩液冷藏或冻干成粉，即得产品。2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法，其特征在于：所述含有幽门螺旋杆菌卵黄抗体的鸡蛋为CagA阳性幽门螺旋杆菌抗原免疫蛋鸡所产的鸡蛋。3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌卵黄抗体的提取方法，其特征在于：步骤（2）中，卵黄溶液在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，于海勤，刘艳平，吴桂平，李文娇，
申请(专利权)人：菏泽睿智科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37