单细胞高通量测序文库构建方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种单细胞高通量测序文库的构建方法及其试剂盒。单细胞高通量测序文库的构建方法包括如下步骤：单细胞裂解、核酸片段化并插入转座子DNA、PCR扩增并加入测序接头以及文库纯化和筛选，得到文库产物。上述单细胞高通量测序文库的构建方法较常规文库构建方法而言大大节约时间。

Construction of single cell high throughput sequencing library and its kit

The invention relates to a construction method of a single cell high throughput sequencing library and a kit thereof. The construction of single cell high throughput sequencing library includes the following steps: single cell lysis, nucleic acid fragmentation and insertion of transposon DNA, PCR amplification and addition of sequencing junctions, library purification and screening, to obtain library products. The method of constructing single-cell high-throughput sequencing libraries mentioned above saves much time compared with the conventional method of constructing libraries.

【技术实现步骤摘要】
单细胞高通量测序文库构建方法及其试剂盒
本专利技术涉及高通量基因测序
，特别是涉及一种单细胞高通量测序文库构建方法及其试剂盒。
技术介绍
新一代高通量测序技术以其低成本、高通量的优势逐渐成为分子检测技术的主流，被成功应用到各种领域。目前很多科学研究和临床检测需要在单细胞或微量基因组水平进行，构建单细胞水平高通量测序文库是进行单细胞高通量测序的前提。目前通用的单细胞高通量测序文库的构建方法是在传统高通量测序文库构建前，首先使用全基因组扩增(wholegenomeamplification，WGA)技术进行单细胞基因组放大，以满足建库样本量需求，然后再进行传统高通量测序文库构建。传统高通量测序文库构建主要包括超声破碎或酶切法对靶基因组进行片段化，然后通过末端修复、加接头、PCR扩增及磁珠纯化等一系列过程。故整个单细胞高通量测序文库构建流程耗时极长且操作复杂，难以达到某些检测的时效性要求；另外因为单细胞全基因组扩增和建库中存在多次PCR扩增步骤，带来的扩增偏倚严重影响检测结果的真实性。因此，研发单细胞水平的新一代快速高通量测序文库构建和试剂盒进行高通量测序，已成为分子生物学研究中的迫切需求。
技术实现思路
基于此，有必要针对传统单细胞高通量测序文库构建流程操作复杂、耗时长，文库构建质量低的问题，提供一种单细胞高通量测序文库的构建方法及其试剂盒。本专利技术提供一种单细胞高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：取单细胞样本，加入单细胞裂解试剂以释放单细胞中的基因组DNA，得到含有单细胞基因组DNA的混合液，所述单细胞裂解试剂包括细胞裂解液和蛋白酶；将所述含有单细胞基因组DNA的混合液加入到转座片段化反应体系溶液中孵育，得到连接有转座子DNA序列的单细胞基因组DNA片段，其中，所述转座片段化反应体系溶液中包括转座酶复合物，所述转座酶复合物包括转座酶以及与所述转座酶连接的两条转座子；将连接有转座子DNA序列的单细胞基因组DNA片段置入PCR反应体系中进行PCR扩增，得到带有测序接头的DNA片段，所述PCR反应体系中含有两条具有特异性识别标签的测序接头引物；将所述带有测序接头的DNA片段纯化、筛选，得到文库产物。上述单细胞高通量测序文库的构建方法较常规文库构建方法而言大大节约时间，并且操作更简单，实现了直接以单细胞样本为材料的快速建库，且具有很高的扩增均一性、覆盖度和拷贝数变异分辨率。此外，单细胞高通量测序文库的构建方法中所采用的单细胞裂解试剂优能够将细胞完全裂解，进而将DNA的充分释放。从而能够在单细胞水平上构建高水平文库。具体而言，将经组装的携带有转座酶的转座子的序列(两条DNA)插入单细胞基因组DNA中，酶切DNA的同时，使片段化DNA两端带有相同序列的转座子DNA序列，然后再放入PCR反应溶液(包括测序P接头引物、测序A接头引物)中经PCR扩增使片段化DNA加上测序特异性接头(A接头和P接头)，进而省去了常规建库过程中需要对裂解后的单细胞基因组DNA进行全基因组扩增以及磁珠纯化等一系列繁琐的过程，以使文库可在90分钟内完成构建。综上所述，本专利技术单细胞高通量测序文库的构建方法具有如下优点：1、操作简单，直接以单细胞样本为材料进行快速建库，省去了常规单细胞高通量测序文库构建需要单细胞全基因组扩增、传统酶切、反复纯化等复杂操作。2、单细胞高通量测序文库构建耗时短，90分钟内即可完成。3、只有一次PCR扩增，避免了反复扩增偏倚对检测结果真实性的负面影响，具有很高的扩增均一性、覆盖度和拷贝数变异分辨率。在其中一个实施例中，所述单细胞样本选自极体细胞、卵裂球细胞、滋养外胚层细胞、肿瘤细胞、外周血白细胞、血浆细胞和羊水细胞中的任意一种。在其中一个实施例中，细胞裂解液释放单细胞中基因组DNA的反应条件为：75℃，5～60min，热盖105℃；然后加入0.5-5μL浓度为25mg/ml的蛋白酶，55℃，10～300min，热盖70℃；最后75℃，5～30min，热盖105℃。在其中一个实施例中，所述含有单细胞基因组DNA的混合液在转座片段化反应体系溶液中的反应条件为：30℃孵育5min，再66℃反应3min。本专利技术还提供了一种用于单细胞高通量测序文库构建的试剂盒。一种用于单细胞高通量测序文库构建的试剂盒，包括单细胞裂解试剂、转座片段化试剂以及PCR反应试剂，所述单细胞裂解试剂中包括细胞裂解液和蛋白酶，转座片段化试剂包括转座酶混合液、转座反应缓冲液、MgCl2、高保真DNA聚合酶，所述转座酶混合液含有转座酶复合物，所述转座酶复合物包括转座酶以及与所述转座酶连接的两条转座子，所述PCR反应试剂中包括引物Mix溶液，所述引物Mix溶液中含有两条具有特异性识别标签的测序接头引物。上述试剂盒在用于单细胞高通量测序文库构建时，能够简化操作、节约时间，实现直接以单细胞样本为材料的快速建库，且具有很高的扩增均一性、覆盖度和拷贝数变异分辨率。在其中一个实施例中，与所述转座酶连接的两条转座子的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。在其中一个实施例中，所述两个具有特异性识别标签的测序接头引物分别为测序A接头引物和测序P接头引物，测序A接头引物和P接头引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示。在其中一个实施例中，所述转座酶为MuA转座酶。在其中一个实施例中，所述细胞裂解液含有终浓度为10～100mM的Tris-HCl、终浓度为0.2～5mM的EDTA、以及终浓度为5～30mM的DTT，且细胞裂解液的pH为8.0。在其中一个实施例中，所述转座片段化试剂中的转座反应缓冲液为4×，MgCl2溶液浓度为44mM，高保真DNA聚合酶为1U/μL的Phusion高保真DNA聚合酶。附图说明图1为本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法与传统单细胞高通量文库构建方法的流程对比图；图2为本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法示意图；图3为本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法与其他单细胞建库方法的均一性对比图；图4a为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法，对起始量100ngDNA的人变异细胞株(del(4)-13.4M)为模板的检测结果峰图；图4b为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法，对起始量1ngDNA的人变异细胞株(del(4)-13.4M)为模板的检测结果峰图；图4c为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法，对起始量500pgDNA的人变异细胞株(del(4)-13.4M)为模板的检测结果峰图；图4d为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法，对起始量100pgDNA的人变异细胞株(del(4)-13.4M)为模板的检测结果峰图；图4e为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法，对起始量15pgDNA的人变异细胞株(del(4)-13.4M)为模板的检测结果峰图；图4f为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法，对起始量6pgDNA的人变异细胞株(del(4)-13.4M)为模板的检测结果峰图；图5a为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法完成的人变异单细胞样本(del(2)-19.4M)检测情况图；图5b为使用本专利技术的单细胞高通量测序文库的构建方法完成的人变异单细胞样本(del(2)-34.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：取单细胞样本，加入单细胞裂解试剂以释放单细胞中的基因组DNA，得到含有单细胞基因组DNA的混合液，所述单细胞裂解试剂包括细胞裂解液和蛋白酶；将所述含有单细胞基因组DNA的混合液加入到转座片段化反应体系溶液中孵育，得到连接有转座子DNA序列的单细胞基因组DNA片段，其中，所述转座片段化反应体系溶液中包括转座酶复合物，所述转座酶复合物包括转座酶以及与所述转座酶连接的两条转座子；将连接有转座子DNA序列的单细胞基因组DNA片段置入PCR反应体系中进行PCR扩增，得到带有测序接头的DNA片段，所述PCR反应体系中含有两条具有特异性识别标签的测序接头引物；将所述带有测序接头的DNA片段纯化、筛选，得到文库产物。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：取单细胞样本，加入单细胞裂解试剂以释放单细胞中的基因组DNA，得到含有单细胞基因组DNA的混合液，所述单细胞裂解试剂包括细胞裂解液和蛋白酶；将所述含有单细胞基因组DNA的混合液加入到转座片段化反应体系溶液中孵育，得到连接有转座子DNA序列的单细胞基因组DNA片段，其中，所述转座片段化反应体系溶液中包括转座酶复合物，所述转座酶复合物包括转座酶以及与所述转座酶连接的两条转座子；将连接有转座子DNA序列的单细胞基因组DNA片段置入PCR反应体系中进行PCR扩增，得到带有测序接头的DNA片段，所述PCR反应体系中含有两条具有特异性识别标签的测序接头引物；将所述带有测序接头的DNA片段纯化、筛选，得到文库产物。2.根据权利要求1所述的单细胞高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述单细胞样本包括极体细胞、卵裂球细胞、滋养外胚层细胞、肿瘤细胞、外周血白细胞、血浆细胞和羊水细胞中的任意一种。3.根据权利要求1所述的单细胞高通量测序文库的构建方法，其特征在于，细胞裂解液释放单细胞中基因组DNA的反应条件为：75℃，5～60min，热盖105℃；然后加入0.5-5μL浓度为25mg/ml的蛋白酶，55℃，10～300min，热盖70℃；最后75℃，5～30min，热盖105℃。4.根据权利要求1-3中任一项所述的单细胞高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述含有单细胞基因组DNA的混...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丁丁，李文，冒燕，刘慧敏，孔令印，梁波，
申请(专利权)人：苏州贝康医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32