一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术快速创制番茄雄性不育系的方法及其应用。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对番茄Solyc03g053130基因进行编辑，进而通过自交获得纯合且不含CAS9转基因的雄性不育突变体。本发明专利技术还公开了一种辅助鉴定雄性不育株的方法，该方法是检测番茄基因组中Solyc03g053130基因中SNP1606的基因型，若待测番茄基因组SNP1606的基因型为T/T纯合，则待测番茄为或候选为雄性不育株。本发明专利技术创制番茄雄性不育系和检测雄性不育株的方法，可应用于其他番茄品系，具有极大的育种应用前景和经济价值。

A Method for Creating Male Sterile Lines of Tomato by Genome Editing and Its Application

The invention discloses a method for rapidly creating a tomato male sterile line by using CRISPR/Cas9 genome editing technology and its application. The present invention utilizes CRISPR/Cas9 genome editing technology to edit tomato Solyc03g053130 gene, and then obtains homozygous male sterile mutant without CAS9 gene by self-crossing. The invention also discloses a method for assistant identification of male sterile plants. The method is to detect the genotype of SNP1606 in Solyc03g053130 gene in tomato genome. If the genotype of SNP1606 in tomato genome is T/T homozygous, the tomato to be tested is a male sterile plant or candidate. The invention invents a method for producing tomato male sterile lines and detecting male sterile plants, which can be applied to other tomato lines, and has great breeding application prospect and economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种通过基因组编辑创制番茄雄性不育系的方法及其应用。
技术介绍
番茄(Solanumlycopersicum)，属茄科番茄属，是一种世界范围广泛种植的重要蔬菜作物，也是人们日常生活中喜爱的一种水果替代品，在我国设施蔬菜生产中占有重要地位。番茄作为一种严格的自花授粉作物，其杂种优势明显，杂种整齐度高、抗逆性强，因此在生产上主要以杂交种为主。目前番茄的杂交制种主要以人工去雄授粉的方式进行，这种方式劳动力成本较高，且易发生种子不纯等种子安全问题。在制种时引入雄性不育系可以优化制种程序，降低劳动力成本，提高杂种种子纯度以及避免亲本流失。因此番茄雄性不育系的选育意义重大。雄性不育(Malesterility)指有性繁殖过程中，由于生理或遗传上的原因造成植物的雌性器官正常，雄性器官不正常，不能产生花粉或花粉败育而不能授粉的现象。雄性不育主要分为细胞质不育和和细胞核不育两种类型(王超等，2013；杨莉芳等，2013；马西青等，2013)。早在上世纪30年代开始，人们就开始了番茄雄性不育的相关研究。迄今为止，全世界范围内共报道了60余份番茄雄性不育材料，均属于细胞核基因控制的“核不育类型”(Susanetal.,1997；陈玉辉等，2004；邢虎成等，2004)。这其中包括至少3份功能不育类型(花药不开裂或柱头外露)，6份结构不育类型(雄蕊退化或无雄蕊)和40余份花粉败育类型(花粉发育缺陷)。人们在自然资源中没有发现细胞质不育类型的番茄雄性不育材料，但通过用远缘杂交或基因工程等手段获得了一些细胞质雄性不育类型。自然资源中现有的各类番茄雄性不育材料各有优缺点,限制了在杂交制种中的应用。(1)柱头外露类型虽自花传粉有困难,但在群体种植情况下,容易发生邻株、邻花之间的传粉，从不育系应用与制种生产的角度分析，这种不育类型不能避免自交的可能性，容易发生种子事故；并且此类型的不育性易受环境影响，导致不育性稳定性差。(2)花药不开裂类型基本上可避免自交的可能性，但因花柱短于雄蕊花药筒,不能够直接进行授粉，仍需要进行去雄，操作复杂，而且部分组合表现为配合力低、熟期较晚等缺点，此类不育系仅在保加利亚、捷克等东欧国家有应用。(3)无雄蕊或雄蕊退化类型也可完全避免自交，但这类材料的结实率较低，果实内种子含量少，农艺性状一般较差,很难应用(Susanetal.,1997；陈玉辉等，2004；邢虎成等，2004)。(4)人们在自然资源中发现的40余份花粉败育类型在番茄杂交制种中具有较大的应用潜力，这类材料一般受一对隐性核基因控制，需要紧密连锁的分子标记辅助不育性状的鉴定和转育。由于目前绝大多数不育基因尚未克隆，这类不育材料在杂交制种中的应用受到很大限制。制约隐性核不育系在番茄杂交制种中广泛应用的另一因素是难以找到有效的保持系，不能大量产生不育系种子供制种用，只能以杂合体形式保存。以不育株为母本，杂合可育株为父本进行杂交，其子代将按1:1比例分离出纯合不育株和杂合可育株。采用这种作法可以较大量地繁殖不育株与可育株的混合群体，这种群体内既有不育株又有保持不育能力的杂合植株，因此称之为两用系。如何从两用系中快速、准确地选择出雄性不育株作为母本制种已成为一个亟待解决的技术问题。定位克隆雄性不育基因，通过分子标记可高效准确地进行不育株选择，但此方法增加了成本和技术难度，且目前适用此方法的也仅有ps-2，ms-10和ms-15三个雄不育突变体。此外，人们也尝试将一些与雄性不育紧密连锁的苗期标记性状引入不育系，利用苗期标记性状辅助不育株的选择。目前广泛应用的雄性不育突变体ms-10和绿茎aa紧密连锁，通过aa这一苗期标记性状来选择雄性不育突变体，选择效率可达到90％(Jeongetal.,2014；Zhang,L.etal.2016)。此方法的缺点在于不能保证100％的准确率，后期需要二次选择或利用隐性苗期标记性状在杂交种中甄别假杂种。基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被DNA修复系统修复过程中产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。规律成簇间隔短回文重复系统(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/Cas,CRISPR/Cas)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。近年来，人们将Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造成为第三代基因编辑技术，即CRISPR/Cas9技术(Hsuetal.,2014；Lander,2016)。理论上来讲，CRISPR/Cas9技术可对任意品种的任意基因进行操作，实现对核心亲本目标性状的快速、精准改良而不存在传统回交育种常见的连锁累赘等问题，在作物遗传育种中显现出巨大的应用前景(Huangetal.,2016)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育番茄雄性不育系的方法。本专利技术提供的培育番茄雄性不育系的方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到番茄雄性不育系。上述方法中，所述育性基因为编码Solyc03g053130蛋白的基因；所述Solyc03g053130蛋白是下述1)或2)：1)氨基酸序列是序列13所示的蛋白质；2)将序列13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由1)衍生的蛋白质。上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA；所述sgRNA的靶序列为序列2所示的DNA分子。上述方法中，所述编辑的方法为将向所述受体番茄中导入番茄基因组编辑的载体。所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因。在本专利技术的具体实施例中，所述番茄基因组编辑的载体为pKSE401-sgRNA，其为将序列2所示的DNA分子插入pKSE401载体的BsaI的酶切位点间，且保持pKSE401载体的其他序列不变得到的载体。本专利技术的培育番茄雄性不育系的方法还包括筛选Solyc03g053130纯合突变体的步骤。由于番茄是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的Solyc03g053130基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，Solyc03g053130纯合突变体是指两条同源染色体的Solyc03g053130基因发生了相同的突变且不携带外源DNA片段的植株。所述筛选的方法具体如下：采用序列7和序列8所示的引物对T0代再生番茄植株进行PCR扩增和测序。选择和野生型植株相比，靶序列出现核苷酸缺失或插入的T0代再生番茄植株，即为Solyc03g053130基因被编辑的植株。将Solyc03g053130基因被编辑的植株进行自交，并收获种子，再将所得种子进行播种；待长出真叶后，采用序列5和序列6所示的引物对其Cas9基因片段进行PCR克隆和电泳，选择不携带Cas9基因片段的T1代再生番茄植株，再采用序列7和序列8所示的引物对Solyc03g053130基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育番茄雄性不育系的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到番茄雄性不育系。

【技术特征摘要】
1.一种培育番茄雄性不育系的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对受体番茄基因组中的育性基因进行编辑，进而使所述育性基因功能丧失，得到番茄雄性不育系。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述育性基因为编码Solyc03g053130蛋白的基因；所述Solyc03g053130蛋白是下述1)或2)：1)氨基酸序列是序列13所示的蛋白质；2)将序列13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由1)衍生的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA；所述sgRNA的靶序列为序列2所示的DNA分子。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述编辑的方法为将向所述受体番茄中导入番茄基因组编辑的载体；或，所述番茄基因组编辑的载体为将序列2所示的DNA分子插入pKSE401载体的BsaI的酶切位点间，且保持pKSE401载体的其他序列不变得到的载体；或，所述方法还包括筛选Solyc03g053130纯合突变体的步骤。5.如下(1)-(4)中任一种生物材料：(1)权利要求4中所述的番茄基因组编辑的载体；(2)含有权利要求4中所述的番茄基因组编辑的载体的微生物转化体；(3)权利要求3中所述的靶序列；(4)序列9所示的Solyc03g053130基因的突变序列。6.权利要求5中所述的番茄基因组编辑的载体或微生物转化体或靶序列或突变序列在培育番茄雄性不育系中的应用；或，权利要求5中所述的番茄基因组编辑的载体或微生物转化体或靶序列或突变序列或权利要求1-4中任一所述的方法获得的番茄雄性不育...

【专利技术属性】
技术研发人员：李常保，杜敏敏，李传友，邓磊，周明，温常龙，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11