甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法，其方法工艺为：（1）所述甜叶菊渣样品用乙醇水溶液萃取，萃取液浓缩，得到浓缩液；（2）所述浓缩液用高速冷冻离心机离心，上清液过大孔吸附树脂净化，用乙醇水溶液解析，解析液浓缩，得到浓缩净化液；（3）所述浓缩净化液用阴离子交换树脂净化，收集过柱液；（4）所述过柱液蒸发至干，用甲醇‑盐酸水溶液或乙醇‑盐酸水溶液定容，得到样品溶液；（5）样品溶液采用反相高效液相色谱‑紫外法检测，外标法定量。本方法通过树脂富集目标成分，极大的降低了检出限；通过高速冷冻离心机离心，氯型阴离子交换树脂净化，排除了绝大部分杂质的干扰。

Detection of Four Flavonoids in Stevia rebaudiana Residue

The invention discloses a detection method for four flavonoid components in Stevia residue, the method and process are: (1) the stevia residue sample is extracted with ethanol aqueous solution, the extract is concentrated, and the concentrated liquid is obtained; (2) the concentrated liquid is centrifuged by a high-speed freezing centrifuge, the supernatant is purified by macroporous adsorption resin, and is resolved by ethanol aqueous solution, and the concentrated solution is obtained. Chemical solution; (3) The concentrated purifying solution is purified by anion exchange resin, and the column liquid is collected; (4) The column liquid is evaporated to dry, and the sample solution is obtained by volumetric determination with methanol, hydrochloric acid or ethanol and hydrochloric acid solution; (5) The sample solution is detected by reversed phase high performance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry, and quantified by external standard method. The detection limit was greatly reduced by enriching the target components with resin, and the interference of most impurities was eliminated by centrifuging with high-speed freezing centrifuge and purifying with chlorine anion exchange resin.

【技术实现步骤摘要】
甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法
本专利技术涉及一种黄酮类成分的检测方法，尤其是一种甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法。
技术介绍
黄酮类化合物是自然界广泛存在的一类化合物，在高等植物体内分布较多，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。大量研究表明，黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肌瘤、抗氧化、抗自由基、抗炎、镇痛和保肝等功能，已被列为保健食品的一类功能因子。黄酮类化合物以纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点日益受到人们的关注。甜叶菊渣是甜叶菊提取甜菊糖苷后的废弃物，其除含有水分、粗脂肪、粗纤维等之外还含有黄酮类、挥发油等活性物质。目前，中国是世界最大的甜菊糖苷生产国，所产废弃物甜叶菊渣数量巨大，严重污染环境、浪费资源。现已有文献报道，关于从甜叶菊中同时提取甜叶菊糖苷和黄酮，及从甜叶菊渣中提取纯化黄酮类化合物。这将大大提升甜叶菊的综合利用价值，减少甜叶菊渣的环境污染，潜在发展前景广泛。目前，关于黄酮类化合物的检测方法有很多，主要有紫外可见分光光度计法、高效液相色谱法、红外光谱仪法、质谱法等，但针对甜叶菊渣中黄酮类化合物的检测方法尚未见文献报道。由于不同产品基质不同，所含黄酮类苷元不同，而且现有黄酮类化合物高效液相色谱检测方法，检测时间长，检出限高，不适用于提取后甜叶菊渣中黄酮类化合物的检测，因此专门建立一种适用于甜叶菊渣中黄酮类化合物含量的检测方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、准确的甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的方法工艺为：（1）甜叶菊渣称取0.5～2.0g，用80±2vol%乙醇水溶液超声萃取，料液比为1:5～20，提取温度为60～90℃，超声频率为750HZ；然后旋转蒸发仪浓缩为溶剂含量≤1wt%的浓缩液；（2）所述浓缩液用高速冷冻离心机离心，转速为7000～10000r/min离心温度为0～5℃；离心所得上清液过大孔吸附树脂净化，50%±1%乙醇水溶液解析，所述大孔吸附树脂为D101或AB-8；所得解析液用旋转蒸发仪浓缩为溶剂含量为8±1wt%的浓缩净化液；（3）所述浓缩净化液用阴离子交换树脂净化，收集过柱液；所述阴离子交换树脂为转成氯型阴离子交换树脂SQ-338、D941或762；（4）所述过柱液浓缩至干，用甲醇-盐酸水溶液或乙醇-盐酸水溶液定容至1～5mL，得到样品溶液；所述盐酸水溶液浓度为20～30wt%，甲醇或乙醇与盐酸水溶液的体积比为1:0.5～1；（5）样品溶液采用反相高效液相色谱-紫外法检测，外标法定量；所述反相高效液相色谱条件为：等度洗脱，色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇-三氟乙酸水体系或乙腈-三氟乙酸水体系；所述C18柱的规格为100mm×4.6mm，粒径3.5-5μm；选用ZORBAXElipsePlusC18柱、PhenomenexKinetexC18柱、SB-C18柱或XB-C18柱；所述流动相为体积比(30～50):(70～50)甲醇-三氟乙酸水体系或体积比(30～50):(70～50)乙腈-三氟乙酸水体系。本专利技术所述步骤（5）中，紫外检测波长为360nm。本专利技术所述步骤（3）中，所述氯型阴离子交换树脂转换方法为：阴离子交换树脂装柱后用3BV、4wt%的HCl溶液以1BV/h的流速通过树脂层进行酸洗；酸洗过程中，前1BV流出后，停止过柱，浸泡2小时，剩余HCl溶液按照1BV/h的流速通过树脂柱；酸液过完后用4BV一次水冲洗，控制pH＞3。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：（1）通过树脂富集目标成分，极大的降低了检出限；（2）通过高速冷冻离心机离心，氯型阴离子交换树脂净化，排除了绝大部分杂质的干扰；（3）建立了一种适用性极强、检测时间短的甜叶菊渣中四种黄酮类成分反相高效液相色谱检测方法；（4）为甜叶菊黄酮工业化生产质量控制提供保障。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术反相高效液相色谱-紫外检测四种黄酮类色谱图；图2是本专利技术反相高效液相色谱-紫外检测四种黄酮类标准曲线。具体实施方式本甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法采用下述工艺：（1）标准曲线：准确称取15mg槲皮素、10mg木犀草素、10mg山奈酚、10mg芹菜素（精确至0.1mg）标准品各置于25mL棕色容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，配成标准储备液。其标准曲线，由标准储备液2倍梯度逐级稀释，做六个梯度水平，采用下述步骤（6）反相高效液相色谱-紫外法检测，测定其峰面积值，以峰面积-浓度作标准曲线。（2）称取甜叶菊渣样品0.5～2.0g；然后用80±2vol%乙醇水溶液超声萃取，料液质量体积比为1:5～20，提取次数为1～3次，提取时间每次为10～30min；提取温度为60～90℃，超声频率为750HZ；萃取液用旋转蒸发仪浓缩至溶剂含量≤1wt%，得到浓缩液。（3）所述浓缩液用高速冷冻离心机离心，转速为7000～10000r/min，离心时间为5～10min，离心温度为0～5℃；离心的上清液过大孔吸附树脂净化，50±1wt%乙醇水溶液解析；所述大孔吸附树脂为D101或AB-8；解析液用旋转蒸发仪浓缩至溶剂含量为8±1wt%，得到浓缩净化液。（4）所述浓缩净化液用阴离子交换树脂净化，收集过柱液；所用阴离子交换树脂为转成氯型阴离子交换树脂SQ-338、D941、762中的任意一种。所述氯型阴离子交换树脂转换方法为：阴离子交换树脂装柱后用3BV、4wt%的HCl溶液以1BV/h的流速通过树脂层进行酸洗；酸洗过程中，前1BV流出后，停止过柱，浸泡2小时，剩余2BV的HCl溶液按照1BV/h的流速通过树脂柱；酸液过完后用4BV一次水冲洗，控制冲洗后树脂pH＞3。（5）所述过柱液用旋转蒸发仪浓缩至干，用甲醇-盐酸水溶液或乙醇-盐酸水溶液定容，得到样品溶液。所述甲醇-盐酸水溶液或乙醇-盐酸水溶液中的盐酸水溶液的浓度为20～30wt%，甲醇或乙醇与盐酸水溶液的体积比为1:0.5～1；定容体积为1～5mL。（6）样品溶液采用反相高效液相色谱-紫外法检测，外标法定量。所述反相高效液相色谱条件为等度洗脱，色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇-三氟乙酸水体系或乙腈-三氟乙酸水体系。具体为：Agilent1260液相色谱仪配紫外检测器（美国Agilent公司），色谱柱的规格为100mm×4.6mm，粒径3.5～5μm；选用ZORBAXElipsePlusC18柱、PhenomenexKinetexC18柱、SB-C18柱或XB-C18柱。流动相为体积比(30～50):(70～50)甲醇-三氟乙酸水体系或体积比为(30～50):(70～50)乙腈-三氟乙酸水体系，紫外检测器的检测波长为360nm，进样量为5～20μL，流速为1.0mLmin-1。计算机系统记录色谱图，以峰面积作为信号响应值，对四种甜叶菊黄酮：槲皮素、山奈酚、芹菜素和木犀草素进行定性定量分析。实施例1：本甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法的具体步骤如下所述。（1）标准曲线：准确称取15mg槲皮素、10mg木犀草素、10mg山奈酚、10mg芹菜素（精确至0.1mg）标准品各置于25mL棕色容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，配成标准储备液。其标准曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法，其特征在于，其方法工艺为：（1）甜叶菊渣称取0.5～2.0g，用80±2vol%乙醇水溶液超声萃取，料液比为1:5～20，提取温度为60～90℃，超声频率为750HZ；然后旋转蒸发仪浓缩为溶剂含量≤1wt%的浓缩液；（2）所述浓缩液用高速冷冻离心机离心，转速为7000～10000r/min离心温度为0～5℃；离心所得上清液过大孔吸附树脂净化，50%±1%乙醇水溶液解析，所述大孔吸附树脂为D101或AB‑8；所得解析液用旋转蒸发仪浓缩为溶剂含量为8±1wt%的浓缩净化液；（3）所述浓缩净化液用阴离子交换树脂净化，收集过柱液；所述阴离子交换树脂为转成氯型阴离子交换树脂SQ‑338、D941或762；（4）所述过柱液浓缩至干，用甲醇‑盐酸水溶液或乙醇‑盐酸水溶液定容至1～5mL，得到样品溶液；所述盐酸水溶液浓度为20～30wt%，甲醇或乙醇与盐酸水溶液的体积比为1:0.5～1；（5）样品溶液采用反相高效液相色谱‑紫外法检测，外标法定量；所述反相高效液相色谱条件为：等度洗脱，色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇‑三氟乙酸水体系或乙腈‑三氟乙酸水体系；所述C18柱的规格为100mm×4.6mm，粒径3.5‑5μm；选用ZORBAXElipsePlusC18柱、PhenomenexKinetexC18柱、SB‑C18柱或XB‑C18柱；所述流动相为体积比 (30～50):(70～50)甲醇‑三氟乙酸水体系或体积比(30～50):(70～50)乙腈‑三氟乙酸水体系。...

【技术特征摘要】
1.一种甜叶菊渣中四种黄酮类成分的检测方法，其特征在于，其方法工艺为：（1）甜叶菊渣称取0.5～2.0g，用80±2vol%乙醇水溶液超声萃取，料液比为1:5～20，提取温度为60～90℃，超声频率为750HZ；然后旋转蒸发仪浓缩为溶剂含量≤1wt%的浓缩液；（2）所述浓缩液用高速冷冻离心机离心，转速为7000～10000r/min离心温度为0～5℃；离心所得上清液过大孔吸附树脂净化，50%±1%乙醇水溶液解析，所述大孔吸附树脂为D101或AB-8；所得解析液用旋转蒸发仪浓缩为溶剂含量为8±1wt%的浓缩净化液；（3）所述浓缩净化液用阴离子交换树脂净化，收集过柱液；所述阴离子交换树脂为转成氯型阴离子交换树脂SQ-338、D941或762；（4）所述过柱液浓缩至干，用甲醇-盐酸水溶液或乙醇-盐酸水溶液定容至1～5mL，得到样品溶液；所述盐酸水溶液浓度为20～30wt%，甲醇或乙醇与盐酸水溶液的体积比为1:0.5～1；（5）样品溶液采用反相高效液相色谱-紫外法检测，外标法定...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉桂珍，张晓芳，李松松，程远欣，徐猛，
申请(专利权)人：晨光生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13