血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种血清中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法及试剂盒，血清中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，包括以下步骤：(1)取血清样品于样品管中；(2)向每个样品中加入含有内标混合液的沉淀剂，涡旋混匀；(3)向每个样品中再加入萃取剂，涡旋混匀；(4)样品静置后取上清液于进样管中；(5)室温下氮气吹干后加入复溶液，涡旋后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25‑羟基维生素D和25‑羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25‑羟基维生素D的含量。本发明专利技术所述的血清中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法,可进一步的提高检测准确度、精密度以及缩短前处理时间。

Detection of 25-hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its kit

The invention provides a detection method and kit for 25 hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and a detection method for 25 hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The method comprises the following steps: (1) taking serum samples into sample tubes; (2) adding precipitators containing internal standard mixtures to each sample, and mixing them in a whirlpool; (3) adding them to each sample. The extractant was mixed in a whirlpool; (4) the supernatant was taken after the sample was stationary in the injection tube; (5) the compound solution was added after the nitrogen was dried at room temperature, and then detected by liquid chromatography tandem mass spectrometry after the whirlpool. The content of 25 hydroxyvitamin D in serum was determined by comparing the internal standard peak areas of 25 hydroxyvitamin D and 25 hydroxyvitamin D. The method for detecting 25 hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry can further improve the detection accuracy, precision and shorten the pretreatment time.

【技术实现步骤摘要】
血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法及试剂盒
本专利技术属于25-羟基维生素D检测
，尤其是涉及一种可以同时检测25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的方法和试剂盒。
技术介绍
维生素D有调节钙磷代谢的经典作用和影响细胞增殖分化等非经典作用，是维持人体健康必不可少的一种类固醇激素。维生素D的缺乏时可导致儿童佝偻病和成年人软骨症。近年来，深入的研究表明维生素D缺乏会增加罹患肿瘤、心血管疾病、自发免疫性疾病和精神疾病等常见多发疾患的风险。基于维生素D对于人体健康的重要性和针对目前中国人群维生素D水平偏低的现状，有必要在中国人群中普及维生素D水平检测以及对重点人群进行筛查。25-羟基维生素D(分为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3)水平被定义为维生素D营养状态的功能指标，已经成为国际上公认的衡量维生素D的最佳指标。目前常用的检测25(OH)D含量的方法有竞争性蛋白结合法(CPBA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、高效液相色谱法(HPLC)等。有的方法耗时、步骤冗杂，无法满足临床简便、高通量的要求；有的方法具有放射性污染的潜在风险，对实验人员和环境都有损害；有的方法容易与其他非目标化合物发生交叉反应，导致方法特异性不足，HPLC相对于免疫法可以区分开25(OH)D2和25(OH)D3，但是25(OH)D2浓度太低，液相色谱法检测限达不到要求。随着检测技术及精度的发展，HPLC逐步被液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)所替代。LC-MS/MS是色谱法中最为常用的25(OH)D检测方法，样品经处理后采用液相色谱分离，检测器为串联质谱仪，在多反应监测扫描模式下，可同时检测25(OH)D2和25(OH)D3，具有非常高的灵敏度、特异性和准确性，被国际公认为25(OH)D检测的金标准。体内维生素D浓度的准确定量是诊断维生素D缺乏相关疾病诊断和治疗反馈效果的重要指标。现有的基于液相色谱和串联质谱联用的检测方法大多数为实验室自建方法，缺乏标准化。由于不同的实验室采用的试剂、标准品和样品的处理方法不同，常导致不同实验室之间的检测结果差异大，且在前处理上也会消耗大量的时间。因此，采用包含校准品、萃取试剂、质控品等检测所需试剂的试剂盒进行检测是解决这一问题的重要途径。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，以克服现有技术的缺陷，在高准确度、精密度的前提下进一步的缩短前处理时间，提高工作效率。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，包括以下步骤：(1)取血清样品于样品管中；(2)向每个样品中加入含有内标混合液的沉淀剂，涡旋混匀；(3)向每个样品中再加入萃取剂，涡旋混匀；(4)样品静置后取上清液于进样管中；(5)室温下氮气吹干后加入复溶液，涡旋后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25-羟基维生素D和25-羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25-羟基维生素D的含量。应当说明的是，本专利技术中的液相色谱串联质谱法采用液相色谱串联质谱联用仪。优选的，步骤(2)中，内标混合液包括25-羟基维生素D2内标和25-羟基维生素D3内标。优选的，步骤(1)中，血清的选用量为90-200μL；步骤(2)中，含有内标混合液的沉淀剂的用量为300-600μL，其中内标混合液与沉淀剂的体积比为1:(10-30)，涡旋混匀时间为30-90s；步骤(3)中，萃取剂的用量为800-1000μL，涡旋混匀时间为60-120s；步骤(4)中，样品静置时间为30-90s，加入进样管的上清液体积为750-900μL；步骤(5)中，复溶液的用量为100-200μL，涡旋时间为30-60s；进一步优选的，步骤(1)中，血清的选用量为100μL；步骤(2)中，含有内标混合液的沉淀剂的用量为310μL，其中内标混合液与沉淀剂的体积比为1:(10-30)，涡旋混匀时间为60s；步骤(3)中，萃取剂的用量为900μL，涡旋混匀时间为120s；步骤(4)中，样品静置时间为60s，加入进样管的上清液体积为800μL；步骤(5)中，复溶液的用量为100μL，涡旋时间为30s。优选的，步骤(2)中，沉淀剂为甲醇和乙腈按体积比1:1混合的混合溶液；步骤(3)中，萃取剂为HPLC级正己烷；步骤(5)中，复溶液为40-60v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50～80v/v％的甲醇水溶液；优选的，步骤(5)中，复溶液为50v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50v/v％的甲醇水溶液。应当说明的是，洗针液的作用在于平衡测定前后流动相、辅助测定、清洗探针、以及避免前样本对后样本测定的影响。优选的，步骤(5)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件如下：采用梯度洗脱程序，0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液作为流动相A，0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液作为流动相B；优选的，梯度洗脱程序中流动相A采用0.1v/v％的甲酸水溶液，流动相B采用0.1v/v％的甲酸甲醇溶液。优选的，步骤(5)中，梯度洗脱的参数如下：时间流动相A的体积比流动相B的体积比0-2min25→275→982-5min98985-5.5min2→2598→755.5-7min2575优选的，步骤(5)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件还包括：色谱柱：C182.1×100mm，3μm；色谱参数：流动相流速0.4-1.0mL/min，柱温35-60℃，检测时间4-10min，进样量10-50μL；优选的，流动相流速为0.5mL/min，柱温40℃；检测时间7min，进样量30μL。优选的，步骤(5)中，液相色谱串联质谱法检测时的质谱条件包括：。优选的，步骤(5)中，液相色谱串联质谱法检测时的质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为ESI源，采用正离子模式，其他参数如下：优选的，其他参数如下：气帘气CUR(psi)16喷雾器GS1(psi)20辅助加热气GS2(psi)50温度TEM(℃)500接口加热IheON碰撞气CAD(psi)4本专利技术的另一目的在于提出一种用于如上所述的血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法的试剂盒，以将其用于上述血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，检测血清中25-羟基维生素D。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种用于如上所述血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法的试剂盒，包括以下溶液：(1)校准品：5-40ng/mL的25(OH)D2和5-120ng/mL的25(OH)D3；(2)质控品：5.4-23.5ng/mL的25(OH)D2和4.8-64.6ng/mL的25(OH)D3；(3)内标混合液：200ng/mL的25-羟基维生素D2内标和500ng/mL的25-羟基维生素D3内标；(4)沉淀剂：甲醇和乙腈按体积比1:1混合的混合溶液；(5)萃取剂：HPLC级正己烷；(6)复溶液：40～60v/v％的甲醇水溶液；优选的，复溶液为甲醇与水按体积比1:1的混合溶液；(7)流动相：流动相A采用0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液，流动相B采用0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.血清中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取血清样品于样品管中；(2)向每个样品中加入含有内标混合液的沉淀剂，涡旋混匀；(3)向每个样品中再加入萃取剂，涡旋混匀；(4)样品静置后取上清液于进样管中；(5)室温下氮气吹干后加入复溶液，涡旋后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25‑羟基维生素D和25‑羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25‑羟基维生素D的含量。

【技术特征摘要】
1.血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取血清样品于样品管中；(2)向每个样品中加入含有内标混合液的沉淀剂，涡旋混匀；(3)向每个样品中再加入萃取剂，涡旋混匀；(4)样品静置后取上清液于进样管中；(5)室温下氮气吹干后加入复溶液，涡旋后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25-羟基维生素D和25-羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25-羟基维生素D的含量。2.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于：步骤(2)中，内标混合液包括25-羟基维生素D2内标和25-羟基维生素D3内标。3.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于：步骤(1)中，血清的选用量为90-200μL；步骤(2)中，含有内标混合液的沉淀剂的用量为300-600μL，其中内标混合液与沉淀剂的体积比为1:(10-30)，涡旋混匀时间为30-90s；步骤(3)中，萃取剂的用量为800-1000μL，涡旋混匀时间为60-120s；步骤(4)中，样品静置时间为30-90s，加入进样管的上清液体积为750-900μL；步骤(5)中，复溶液的用量为100-200μL，涡旋时间为30-60s；优选的，步骤(1)中，血清的选用量为100μL；步骤(2)中，含有内标混合液的沉淀剂的用量为310μL，其中内标混合液与沉淀剂的体积比为1:(10-30)，涡旋混匀时间为60s；步骤(3)中，萃取剂的用量为900μL，涡旋混匀时间为120s；步骤(4)中，样品静置时间为60s，加入进样管的上清液体积为800μL；步骤(5)中，复溶液的用量为100μL，涡旋时间为30s。4.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于：步骤(2)中，沉淀剂为甲醇和乙腈按体积比1:1混合的混合溶液；步骤(3)中，萃取剂为HPLC级正己烷；步骤(5)中，复溶液为40-60v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50～80v/v％的甲醇水溶液；优选的，步骤(5)中，复溶液为50v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50v/v％的甲醇水溶液。5.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，其特征在于：步骤(5)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件如下：采用梯度洗脱程序，0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液作为流动相A，0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液作为流动相B；优选的，梯度洗脱程序中流动相A采用0.1v/v％的甲酸水...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，许舒欣，李小强，胡玮，贾明正，程文播，
申请(专利权)人：天津国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12