一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25‑羟基维生素D的方法及试剂盒，其中，血清中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，包括以下步骤：(1)取血清与内标工作液于样品管中涡旋混匀；(2)向混匀后的混合液中加入提取剂，涡旋混匀待净化；(3)待净化的样品全部上样，待全部上样浸润后静置；(4)用洗脱剂进行洗脱；(5)收集洗脱液，并用正压装置将残余的液体压下；(6)将收集的洗脱液经氮气吹干，加入复溶液复溶，涡旋一段时间后采用液相色谱串联质谱法进行检测。本发明专利技术所述的血清中25‑羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，可提高检测准确度、精密度以及大大缩短前处理时间，并提高检测通量。

A method and kit for determination of 25-hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

The invention provides a method and a kit for detecting 25 hydroxyvitamin D in serum based on liquid chromatography tandem mass spectrometry, in which the detection method of 25 hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry includes the following steps: (1) mixing serum with internal standard working fluid in a sample tube by eddy; (2) adding extractant to the mixture after mixing, and the eddy mixing is to be cleaned. (3) Samples to be purified are all sampled and placed in a static position after all samples are soaked; (4) eluent is used for elution; (5) eluent is collected and the residual liquid is pressed down by a positive pressure device; (6) eluent is dried by nitrogen gas and dissolved in complex solution, and then detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry after a period of eddy. The method for detecting 25 hydroxyvitamin D in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry can improve detection accuracy, precision, greatly shorten pretreatment time and increase detection flux.

【技术实现步骤摘要】
一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法及试剂盒
本专利技术属于25-羟基维生素D检测
，尤其是涉及一种可以同时检测25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的方法和试剂盒。
技术介绍
维生素D有调节钙磷代谢的经典作用和影响细胞增殖分化等非经典作用，是维持人体健康必不可少的一种类固醇激素。维生素D的缺乏时可导致儿童佝偻病和成年人软骨症。近年来，深入的研究表明维生素D缺乏会增加罹患肿瘤、心血管疾病、自发免疫性疾病和精神疾病等常见多发疾患的风险。基于维生素D对于人体健康的重要性和针对目前中国人群维生素D水平偏低的现状，有必要在中国人群中普及维生素D水平检测以及对重点人群进行筛查。25-羟基维生素D(分为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3)水平被定义为维生素D营养状态的功能指标，已经成为国际上公认的衡量维生素D的最佳指标。目前常用的检测25(OH)D含量的方法有竞争性蛋白结合法(CPBA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、高效液相色谱法(HPLC)等。有的方法耗时、步骤冗杂，无法满足临床简便、高通量的要求；有的方法具有放射性污染的潜在风险，对实验人员和环境都有损害；有的方法容易与其他非目标化合物发生交叉反应，导致方法特异性不足，HPLC相对于免疫法可以区分开25(OH)D2和25(OH)D3，但是25(OH)D2浓度太低，液相色谱法检测限达不到要求。随着检测技术及精度的发展，HPLC逐步被液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)所替代。LC-MS/MS是色谱法中最为常用的25(OH)D检测方法，样品经处理后采用液相色谱分离，检测器为串联质谱仪，在多反应监测扫描模式下，可同时检测25(OH)D2和25(OH)D3，具有非常高的灵敏度、特异性和准确性，被国际公认为25(OH)D检测的金标准。体内维生素D浓度的准确定量是诊断维生素D缺乏相关疾病诊断和治疗反馈效果的重要指标。现有的基于液相色谱和串联质谱联用的检测方法大多数为实验室自建方法，缺乏标准化。由于不同的实验室采用的试剂、标准品和样品的处理方法不同，常导致不同实验室之间的检测结果差异大，且在前处理上也会消耗大量的时间。因此，采用包含校准品、提取试剂、质控品等检测所需试剂的试剂盒进行检测是解决这一问题的重要途径。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，以克服现有技术的缺陷，可提高检测准确度、精密度以及大大缩短前处理时间，并提高检测通量。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法，包括以下步骤：(1)取血清与内标工作液于样品管中涡旋混匀；(2)向混匀后的混合液中加入提取剂，涡旋混匀待净化；(3)待净化的样品在装有填料的柱上上样，待全部上样浸润后静置；(4)用洗脱剂进行洗脱；(5)收集洗脱液，并用正压装置将残余的液体压下；(6)将收集的洗脱液经氮气吹干，加入复溶液复溶，涡旋一段时间后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25-羟基维生素D和25-羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25-羟基维生素D的含量。本专利技术中的液相色谱串联质谱法采用液相色谱串联质谱联用仪。优选的，步骤(1)中，内标工作液包括25-羟基维生素D2内标和25-羟基维生素D3内标。优选的，步骤(1)中，血清的选用量为90-200μL，内标工作液的选用量为5-30μL，涡旋混匀时间为10s；步骤(2)中，提取剂的用量为90-300μL，涡旋混匀时间为50-120s；步骤(3)中，静置时间为3-10min；步骤(4)中，洗脱液的用量为1-3mL,且洗脱液均分3-6次洗脱；步骤(6)中，复溶液的用量为90-200μL，涡旋时间为25-60s；进一步优选的，步骤(1)中，血清的选用量为100μL，内标工作液的选用量为10μL，涡旋混匀时间为10s；步骤(2)中，提取剂的用量为100μL，涡旋混匀时间为60s；步骤(3)中，静置是将为5min；步骤(4)中，洗脱剂的用量为2mL,且洗脱剂均分4次洗脱；步骤(6)中，复溶液的用量为100μL，涡旋时间为30s。优选的，步骤(2)中，提取剂为100mM的氢氧化钠水溶液；步骤(4)-(6)中，洗脱剂为HPLC级异辛烷；步骤(6)中，复溶液为40～60v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50～80v/v％的甲醇水溶液；优选的，步骤(6)中，复溶液为50v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50v/v％的甲醇水溶液。优选的，步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件如下：采用梯度洗脱程序，0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液作为流动相A，0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液作为流动相B；优选的，梯度洗脱程序中流动相A采用0.1v/v％的甲酸水溶液，流动相B采用0.1v/v％的甲酸甲醇溶液。优选的，步骤(6)中，梯度洗脱的参数如下：。优选的，步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件还包括：色谱柱：C182.1×100mm，3μm；色谱参数：流动相流速0.4-1.0mL/min，柱温35-60℃，检测时间4-10min，进样量10-50μL；优选的，流动相流速为0.5mL/min，柱温40℃；检测时间7min，进样量30μL。优选的，步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的质谱条件包括：。优选的，步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为ESI源，采用正离子模式，其他参数如下：气帘气CUR(psi)15-40喷雾器GS1(psi)15-55辅助加热气GS2(psi)40-60温度TEM(℃)450-550接口加热IheON碰撞气CAD(psi)3-10优选的，其他参数如下：气帘气CUR(psi)16喷雾器GS1(psi)20辅助加热气GS2(psi)50温度TEM(℃)500接口加热IheON碰撞气CAD(psi)4本专利技术的另一目的在于提出一种用于如上所述的血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法的试剂盒，以将其上述检测过程中，检测血清中25-羟基维生素D。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种血清中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱联用检测方法的试剂盒，包括以下溶液：(1)校准品：5-40ng/mL的25(OH)D2和5-120ng/mL的25(OH)D3；(2)质控品：5.4-23.5ng/mL的25(OH)D2和4.8-64.6ng/mL的25(OH)D3；(3)内标混合液：200ng/mL的25-羟基维生素D2内标和500ng/mL的25-羟基维生素D3内标；(4)提取剂：100mM的氢氧化钠水溶液；(5)洗脱剂：HPLC级异辛烷；(6)复溶液：40～60v/v％的甲醇水溶液；优选的，复溶液为50v/v％的甲醇水溶液。(7)流动相：流动相A采用0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液，流动相B采用0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液；优选的，流动相A采用0.1v/v％的甲酸水溶液，流动相B采用0.1v/v％的甲酸甲醇溶液；(8)洗针液：50～80v/v％的甲醇水溶液；优选的，洗针液为50v/v％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25‑羟基维生素D的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取血清与内标工作液于样品管中涡旋混匀；(2)向混匀后的混合液中加入提取剂，涡旋混匀待净化；(3)待净化的样品在装有填料的柱上上样，待全部上样浸润后静置；(4)用洗脱剂进行洗脱；(5)收集洗脱液，并用正压装置将残余的液体压下；(6)将收集的洗脱液经氮气吹干，加入复溶液复溶，涡旋一段时间后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25‑羟基维生素D和25‑羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25‑羟基维生素D的含量。

【技术特征摘要】
1.一种基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取血清与内标工作液于样品管中涡旋混匀；(2)向混匀后的混合液中加入提取剂，涡旋混匀待净化；(3)待净化的样品在装有填料的柱上上样，待全部上样浸润后静置；(4)用洗脱剂进行洗脱；(5)收集洗脱液，并用正压装置将残余的液体压下；(6)将收集的洗脱液经氮气吹干，加入复溶液复溶，涡旋一段时间后采用液相色谱串联质谱法进行检测，并通过比较25-羟基维生素D和25-羟基维生素D的内标峰面积来得出待测血清中25-羟基维生素D的含量。2.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法，其特征在于：步骤(1)中，内标工作液包括25-羟基维生素D2内标和25-羟基维生素D3内标。3.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法，其特征在于：步骤(1)中，血清的选用量为90-200μL，内标工作液的选用量为5-30μL，涡旋混匀时间为10s；步骤(2)中，提取剂的用量为90-300μL，涡旋混匀时间为50-120s；步骤(3)中，静置时间为3-10min；步骤(4)中，洗脱液的用量为1-3mL,且洗脱液均分3-6次洗脱；步骤(6)中，复溶液的用量为90-200μL，涡旋时间为25-60s；优选的，步骤(1)中，血清的选用量为100μL，内标工作液的选用量为10μL，涡旋混匀时间为10s；步骤(2)中，提取剂的用量为100μL，涡旋混匀时间为60s；步骤(3)中，静置时间为5min；步骤(4)中，洗脱液的用量为2mL,且洗脱液均分4次洗脱；步骤(6)中，复溶液的用量为100μL，涡旋时间为30s。4.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法，其特征在于：步骤(2)中，提取剂为100mM的氢氧化钠水溶液；步骤(4)-(6)中，洗脱剂为HPLC级异辛烷；步骤(6)中，复溶液为40～60v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50～80v/v％的甲醇水溶液；优选的，步骤(6)中，复溶液为50v/v％的甲醇水溶液，洗针液为50v/v％的甲醇水溶液。5.根据权利要求1所述的基于液相色谱串联质谱法检测血清中25-羟基维生素D的方法，其特征在于：步骤(6)中，液相色谱串联质谱法检测时的色谱条件如下：采用梯度洗脱程序，0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液作为流动相A，0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液作为流动相B；优选的，梯度洗脱程序中流动相A采用0.1v/v％的甲酸水溶液，流动...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，许舒欣，李小强，胡玮，程文播，韩文念，
申请(专利权)人：天津国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12