一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，该方法包括如下步骤：外植体的制备、发根农杆菌的活化、发根农杆菌浸染及共培养、毛状根除菌和继代培养。本发明专利技术经过继代培养最终成功诱导蒲公英产生毛状根，其具有更强的产生次生代谢产物的潜能。采用本发明专利技术进行毛状根诱导所获得的毛状根具有生长速度快、遗传稳定性好的优点。本发明专利技术不仅操作简单、便捷，而且诱导率高，具有大规模生产工业用蒲公英药用成分的替代资源的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种利用发根农杆菌诱导产生蒲公英毛状根的方法，并初步建立了蒲公英毛状根离体培养体系。
技术介绍
发根农杆菌(Agrobaeteriumrhizogenes)是根瘤菌科(Rhi—zobiaceae)农杆菌属(Agrobactefium)一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，通过发根农杆菌感染植物，将其所含的Ri质粒上的一段DNA(T-DNA)转移并整合到植物基因组中，诱导产生毛状根。蒲公英作为一种食药同源植物，是一种具有广阔开发及应用前景的植物资源。我国学者以及临床医学工作者已经证实蒲公英具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、保肝利胆、胃黏膜损伤修复等作用。近年来国内外对蒲公英的抗氧化及医学疗效的研究日益活跃，其在此领域的应用价值引起了越来越多人的关注。利用生物反应器进行蒲公英的工程化生产将成为今后的发展趋势。目前国内外尚未见转化蒲公英发根成功的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，所述方法具体包括如下步骤：步骤一、外植体的制备蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；(2)菌液共培养取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置于人工气候箱中培养1～3d；(3)除菌培养在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中于人工气候箱中培养，每隔3～5d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，且每次转接时用无菌水冲洗外植体5～10次，并用吸水纸吸干表面残存的水分，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；步骤四、毛状根除菌在步骤三除菌培养中的外植体毛状根长至3～5cm，剪取毛状根，置于含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中进行继代培养，直至完全除去农杆菌；步骤五、继代培养将步骤四除菌后的根放于含有1/2MS液体培养基上进行转代培养，黑暗中，24℃～26℃培养，即完成本专利技术所述的利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根。其中，专利技术人通过创造性试验得到最佳制备工艺参数：预培养时间为2天，浸染用菌液浓度OD600为0.7，菌液浸染时间为5min，共培养时间为2天。具体优化试验实施过程参见本
技术实现思路
中的具体实施方式。通过采用上述技术方案，本专利技术的有益效果如下：本专利技术通过利用发根农杆菌成功诱导蒲公英产生毛状根，其具有更强的产生次生代谢产物的潜能。发根可以在培养基内产生次生代谢产物，并可以通过人为的改变生长环境，诱导次生代谢产物不断产生，并分泌于培养基内，便于收集和应用，是取代人工合成蒲公英次生代谢产物的有效途径，为其以后进一步的应用打下了良好的基础。优选的，步骤二中，在扩大培养过程中，按照Rif：LB培养基1:1000的比例，向所述LB液体培养基中添加利福平。优选的，所述利福平由以下方法获得：将提前称量好的利福平用甲醇溶解，加双蒸水定容配制成50mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。优选的，所述乙酰丁香酮由以下方法获得：将提前称量好的乙酰丁香酮用二甲基亚砜和双蒸水1:1溶解，配制成100μmol/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。优选的，所述头孢噻肟钠由以下方法获得：将1g头孢噻肟钠加10mL的双蒸水溶解，配制成100mg/mL的高浓度母液，滤膜过滤，1.5mL离心管分装，并于-20℃下冷藏备用。优选的，步骤一中，所述蒲公英种子在超净工作台中按照以下步骤进行消毒处理：75％医用酒精消毒40s后；再将种子置于4％次氯酸钠溶液中消毒8～10min。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其突出的优点在于：(1)采用本方法进行蒲公英毛状根诱导，毛状根的生成率高，最高达80％，同时所需材料容易获得、操作简单、易行、成本低。(2)采用本方法进行蒲公英毛状根诱导，获得的毛状根在无任何外缘激素的培养基中容易生长，且具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物等特点，是生产次生代谢产物理想的载体。(3)通过本专利技术获得的毛状根易于进行大量繁殖培养，可进行大规模生产以作为工业用蒲公英的替代资源来提取次生代谢产物。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术共培养的图片。图2附图为本专利技术浸染后的图片。图3附图为本专利技术共培养浸染生根的图片。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：步骤一、外植体的制备蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；(2)菌液共培养取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置于人工气候箱中培养1～3d；(3)除菌培养在无菌条件下，将完成共培养的外植体转移至含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中于人工气候箱中培养，每隔3～5d转接一次，并将头孢噻肟钠的浓度降低，且每次转接时用无菌水冲洗外植体5～10次，并用吸水纸吸干表面残存的水分，直至培养到在不含头孢噻肟钠的培养基中培养，且没有菌落生成；步骤四、毛状根除菌在步骤三除菌培养中的外植体毛状根长至3～5cm，剪取毛状根，置于含有100～300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS固体培养基中进行继代培养，直至完全除去农杆菌；步骤五、继代培养将步骤四除菌后的根放于含有1/2MS液体培养基上进行转代培养，黑暗中，24℃～26℃培养，即完成本专利技术所述的利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根。...

【技术特征摘要】
1.一种利用发根农杆菌诱导蒲公英产生毛状根的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：步骤一、外植体的制备蒲公英种子用温水浸泡，选取饱满的蒲公英种子置于容器中，经消毒、冲洗并用无菌纸吸干种子表面残留水分后，将蒲公英种子转接到1/2MS固体培养基上，于温度21℃～23℃、光周期为8h～16h的人工气候箱培养30～35d，待无菌苗长至一定高度时，采取蒲公英外植体进行侵染实验；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌R1601取出，接种菌液于LB固体培养基内，在25℃～30℃的条件下培养2～3d长出单菌落后，在无菌操作的前提下挑取单菌落，并将其转入含LB液体培养基的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床培养18～20h，培养至菌液变浑浊，然后将菌液和LB液体培养基按体积比1:1的比例转入新的离心管中，于温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的条件下进行二次活化；待培养18～20h至菌液变浑浊后，吸取活化过两次的菌液并按照菌液：LB液体培养基＝1:100的比例进行温度为25℃～30℃、转速为150～200r/min的摇床扩大培养，直至测定菌液OD600达到0.5～0.8，用低速冷冻离心机以3000r/min的条件下离心20min，并用MS液体培养基洗涤2～3次，分别重悬至OD600＝0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，所得菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养用剪刀将由步骤一获得的蒲公英无菌苗的叶片根切断后用无菌镊子取出，放置在提前灭过菌的含有无菌吸水纸的平皿中；然后用剪刀或无菌手术刀将叶片的边缘剪出伤口，并将其剪成0.4～0.6cm2的小块，将根剪成0.8～1.2cm长；最后将处理过的外植体接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上培养1～3d，完成外植体的预培养阶段；(2)菌液共培养取出预培养后的外植体，放置于经步骤二活化的菌液中，期间不停震荡，浸染2～15min，后将浸染后的外植体取出，并用吸水纸吸干表面残余的菌液，接种到含有100μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基上置...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐小博，徐萍，庄静静，金振锐，王利平，牛娇娇，王选年，任敏，赵天宇，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：河南,41