肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法技术

本发明专利技术涉及一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法，所述方法，包括以下步骤：将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基培养、离心收集沉淀、渗透胁迫得到粗酶液，对粗酶液进行一次CS(Cellufine Sulfate)柱纯化层析，即可得到高纯度的肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ，本发明专利技术具有工艺简单、易放大，设备需求少，试剂成本低等特点，制备的肝素酶I比活达135IU/mg，纯酶活性收率高达57％，与已有方法相比，纯化收率增加将近一倍。

【技术实现步骤摘要】
肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法
本专利技术涉及一种肝素酶Ⅰ的制备方法，尤其涉及一种使用渗透胁迫产生粗酶，并经一步CS层析纯化制备肝素酶Ⅰ的方法。
技术介绍
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、II、III，这三种酶的酶学特性各不相同。在肝素黄杆菌纯化出的三种肝素酶中，只有肝素酶II的结构被解析，它的底物特异性也最差；肝素酶I则最适用于低分子量肝素的制备。肝素酶Ⅰ是一种分子量大约43kd的单体蛋白质，其等电点为9.0，可能是现有肝素酶中裂解肝素能力最强的酶，目前被大量用于凝血弹力图检测仪配用耗材肝素酶杯中。肝素酶Ⅰ的制备工作有许多研究报道，但已报道的制备工艺大都存在工艺复杂、收率低等缺点。Yang等人(JBiolChem，1985，260(3)：1849-1857)用羟基磷灰石处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，首先制得纯酶，活性收率大约1％；Daniel等人(JBioChem，1992，267(34)：24347-24355)用羟基磷灰石处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石HPLC、Mono-SFPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯酶，活性回收率10.8％；马小来等(食品与药品，2005，32(5)：446-450)使用羟基磷灰石处理、DEAE-Sepharose柱层析、CM-Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到酶，活性收率13.4％；XiaolaiMa等(JChromB，2006，843(2)：209-215)通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose柱层析、CM-650柱层析、SP-650柱层析、sephadexG-100柱层析等五步纯化法获得纯酶，收率达17.8％；中国专利CN200910039360-一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法，公开了一种工艺，通过对粗酶液进行连续三次洗脱条件各不相同的SP-SepharoseFF层析，纯化得到高纯度的酶，获得高达30％的活性收率，为已报道的最高收率制备纯化技术。绝大多数肝素酶制备工艺中粗酶从细胞中的释放采用超声破碎法，该法需要特殊设备，处理效率低，而且制得的粗酶含有的杂蛋白较多导致纯化步骤复杂。Zimmermann等(ApplBiochemBiotechnol.1991Aug；30(2):137-48.)通过渗透胁迫法使得肝素酶从菌体内部释放出来，可免于使用超声破碎仪。本专利技术在借鉴使用渗透压胁迫法制备粗酶时，采用了新的工艺，降低了粗酶中的杂蛋白含量，粗酶从细胞中的释放处理效率大为提高，本专利技术进一步对粗酶进行纯化,发现使用CS柱层析可容易的获得高纯度的酶。而现有技术中使用CS柱层析则需要复杂的层析过程。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的肝素酶Ⅰ的制备方法，可快速有效地通过一次柱层析即获得高纯度酶，进一步提高肝素酶Ⅰ的纯酶活性收率。本专利技术包括下述顺序的步骤：(1)肝素黄杆菌的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天，然后按5％接种量二级种子培养基同样条件培养1天，再按5％接种量接入发酵培养基，培养2-3天，菌液10000rpm、4℃离心30分钟，收集沉淀，为含酶的菌体细胞；(2)渗透胁迫法制备粗酶液：将含酶的菌体细胞4℃悬浮在蔗糖溶液中0.5-24小时，4℃、10000rpm离心30min，取沉淀悬浮于Tris-HCl缓冲液中，冰浴中渗透胁迫提取0.5小时以上，再离心，得到的清液为粗酶提取液，将沉淀再渗透胁迫提取一次，合并二次提取液，即为粗酶液；(3)肝素酶Ⅰ的CS(CellufineSulfate)柱纯化：步骤(2)得到的粗酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱3-6个柱体积，收集有酶活性的含0.35-0.5M氯化钠缓冲液洗脱各管，合并，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到纯化的肝素酶Ⅰ。其中，步骤(1)所述的发酵培养基组成为：肝素8g/L，K2HPO42.5g/L，NaH2PO42.5g/L，NH4Cl2.0g/L，MgCl20.5g/L，组氨酸0.5g/L，甲硫氨酸0.5g/L，微量元素NaMoO3、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2各1×10-4M。步骤(1)所述的种子培养基和二级种子培养基的组成均为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl为0.5％，pH7.0。其中，步骤(2)渗透压胁迫法所用蔗糖溶液为10-40％(m/v)，优选30-40％；所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-50mM，优选10-20mM；Tris-HCl缓冲液含0.1-10mMCaCl2，优选浓度为1-5mM；Tris-HCl缓冲液含50-250mMNaCl，优选浓度为100-200mM；Tris-HCl缓冲液pH6.5-8.0，优选pH7.0-7.5)。其中，步骤(3)所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-150mM，优选10-100mM；其pH在6.5-8.0之间，优选pH7.0-7.5；Tris-HCl缓冲液含0.1-20mMCaCl2，优选浓度为1-10mM。步骤(3)所用CS层析柱的填料优选使用CHISSO公司的亲和层析填料CellufineSulfate，也可使用其它类似亲和填料。对本专利技术所得肝素酶Ⅰ进行活性测定，测定方法如下：肝素酶I活性测定：在5ml石英比色皿中加入在30℃预热过的2.5ml肝素浓度为1mg/ml的Tris-HCl(50mM，含CaCl210mM，pH7.0)缓冲液，移取5-20μl酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。本专利技术中纯化中肝素酶Ⅰ的酶活性为0.3-30IU/ml,最终获得的酶活性为9-10IU/ml。对本专利技术所得肝素酶Ⅰ进行蛋白质浓度测定，测定方法如下：蛋白质浓度测定：向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0.1ml，摇匀，测定A595，根据标准曲线换算蛋白浓度。本专利技术纯化前粗酶蛋白质浓度为0.9-1.0mg/ml，纯化后肝素酶Ⅰ的蛋白质浓度为0.05-0.1mg/ml。本专利技术在现有技术的基础上对现有技术进行了改进，并对每一个步骤中的相关条件进行了筛选，以取得最好结果，本专利技术的筛选过程如下：步骤1步骤2步骤3经过本专利技术的研究改进，本专利技术的制备方法在以下方面优于现有技术根据以上筛选数据，本专利技术的核心改进在于：采用了一种渗透胁迫法将粗酶从细菌细胞中释放出来，并对过程中的蔗糖浓度、缓冲液浓度、氯化钙和氯化钠用量、pH值等做优化。采用CS柱层析，使用了一种缓冲液浓度随氯化钠浓度同时线性梯度上升的洗脱方式，将肝素酶Ⅰ只用一步柱层析即纯化获得，而现有技术基本都需要至少三步柱层析，在层析方法上比本专利技术复杂许多。通过上述改进，本专利技术借鉴采用渗透胁迫法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法，所述方法包括下述步骤：(1)肝素黄杆菌的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上接到种子培养基中培养1天，再接入二级种子培养基培养1天，然后接入发酵培养基，培养1‑2天，离心收集沉淀，为含酶的菌体细胞；(2)渗透胁迫法制备粗酶液：将含酶的菌体细胞悬浮在蔗糖溶液中0.5‑24小时，离心，取沉淀悬浮于Tris‑HCl缓冲液(含CaCl2及NaCl、pH6.5‑8.0)中，冰浴中渗透胁迫提取0.5‑5小时，离心收集清液，将沉淀再如前渗透胁迫提取一次，合并二次提取液，即为粗酶液；(3)肝素酶Ⅰ的CS柱纯化：步骤(2)得到的粗酶液上一根用Tris‑HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡冲洗，再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱3‑6个柱体积，收集有酶活性的含0.35‑0.5M氯化钠缓冲液洗脱各管，合并，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到纯化的肝素酶Ⅰ。

【技术特征摘要】
1.一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法，所述方法包括下述步骤：(1)肝素黄杆菌的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上接到种子培养基中培养1天，再接入二级种子培养基培养1天，然后接入发酵培养基，培养1-2天，离心收集沉淀，为含酶的菌体细胞；(2)渗透胁迫法制备粗酶液：将含酶的菌体细胞悬浮在蔗糖溶液中0.5-24小时，离心，取沉淀悬浮于Tris-HCl缓冲液(含CaCl2及NaCl、pH6.5-8.0)中，冰浴中渗透胁迫提取0.5-5小时，离心收集清液，将沉淀再如前渗透胁迫提取一次，合并二次提取液，即为粗酶液；(3)肝素酶Ⅰ的CS柱纯化：步骤(2)得到的粗酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡冲洗，再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱3-6个柱体积，收集有酶活性的含0.35-0.5M氯化钠缓冲液洗脱各管，合并，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到纯化的肝素酶Ⅰ。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：马小来，郭进京，陈冀中，
申请(专利权)人：深圳市长征生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44