一种寡肽及制药应用制造技术

本发明专利技术公开了一种寡肽及制药应用。肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。本发明专利技术提供的寡肽可以通过抑制NGAL基因表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以制成防治肺癌转移、治疗肺癌的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种寡肽及制药应用
本专利技术属于化学领域，涉及一种寡肽及制药应用。
技术介绍
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种寡肽及制药应用。本专利技术技术方案如下：一种寡肽，其特征在于：序列如SequenceNO.3所示。上述寡肽用作NGAL基因表达抑制剂的用途。上述寡肽用于制备防治肺癌转移的药物的用途。上述寡肽用于制备治疗肺癌的药物的用途。有益效果：肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因。本专利技术提供的寡肽可以通过抑制NGAL基因表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以制成防治肺癌转移、治疗肺癌的药物。附图说明图1为寡肽1～5对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响；图2为寡肽1～5对肺癌A549细胞增殖的影响；图3为寡肽1～5对肺癌A549细胞迁移能力的影响；图4为寡肽1～5对肺癌A549细胞侵袭能力的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料寡肽1～5委托外包机构合成，纯度不低于95％，序列如下：寡肽1：RCRVFYKPWVRHQMRGRYN(SequenceNO.1)；寡肽2：HPWYRKWNYRVRWRGWFMR(SequenceNO.2)；寡肽3：QDRKWSYKSSYFRKRGRSRT(SequenceNO.3)；寡肽4：PHPEGEFRTKMEYRWEYRVR(SequenceNO.4)；寡肽5：PHPEDEFATKFEYRWGYRVR(SequenceNO.5)。胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gbico公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒及定量PCR试剂盒购自TAKARA公司；Tanswell侵袭小室购自millpore公司。NGAL、GAPDH的RT-PCR引物委托外包机构合成。二、实验方法1、细胞培养肺癌A549细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基置37℃、5％CO2条件下培养。2、分组及给药取对数生长期的肺癌A549细胞，随机分组给药：对照组：使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养；寡肽1组：在对照组基础上添加5μM寡肽1培养；寡肽2组：在对照组基础上添加5μM寡肽2培养；寡肽3组：在对照组基础上添加5μM寡肽3培养；寡肽4组：在对照组基础上添加5μM寡肽4培养；寡肽5组：在对照组基础上添加5μM寡肽5培养。3、寡肽对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化、计数，2×105个/孔铺于24孔板，待细胞贴壁后，按照上述分组方法分组并更换为对应的培养基培养，每组设3个平行孔，继续培养48h，弃去上清，收集细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计分别测定RNA浓度，根据吸光度OD260和OD280比值判定纯度。分别取5μg细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，以cDNA为模板应用。反应条件为：94℃预热3min，然后94℃30s，52℃30s，72℃50s，扩增29个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过ImageJ图像分析软件分析各电泳条带的灰度值，以目的条带的灰度值与GAPDH内参照条带的灰度值的比值表示目的基因mRNA的相对表达量。NGAL的上游引物为5′-GAAGACAAAGACCCGCAAAAG-3′，其下游引物序列为5′-CTGGCAACCTGGAACAAAAG-3′。内参GAPDH的上游引物序列为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为5′-TCCACCACCCTGTGCTGTA-3′。4、MTT法检测寡肽对肺癌A549细胞的增殖抑制作用将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化、计数，4×104个/孔铺于96孔板，待细胞贴壁后，按照上述分组方法分组并更换为对应的培养基培养，每组设6个平行孔，继续培养48h，弃去上清，各孔加入无血清培养基溶解的MTT，孵育4h，以二甲基亚砜溶解后于酶标仪570nm处测量吸光度值。5、细胞迁移能力检测将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化，离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，按照上述分组及给药方法于37℃、体积分数5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。培养48h后，消化收集细胞，用无血清DMEM培养基制成细胞悬液，以2.5×104个/孔的密度接种于6孔板，当细胞呈单层贴壁且接近100％融合时，使用10μl无菌移液器头在6孔板中划痕，清洗悬浮脱落细胞后，用无血清培养液，放置于37℃、5％CO2培养箱内，分别于划痕后0和48h在倒置光学显微镜下拍照，计算其划痕愈合率，实验重复3次。划痕愈合率＝(0h划痕距离－48h后划痕距离)/0h划痕距离×100％。6、细胞侵袭能力检测将肺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中，取对数生长期的细胞消化，离心，弃上清，采用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，按照上述分组及给药方法于37℃、体积分数5％CO2饱和湿度培养箱中培养48h。培养48h后，消化收集细胞，用无血清DMEM培养基制备细胞悬液，以2.5×105/孔的密度铺于Transwell小室上层腔室。然后，将含体积分数20％胎牛血清的DMEM培养基加入Transwell小室下层腔室。培养24h后，用棉签从Transwell小室上层腔室移走非侵袭的细胞，取Transwell小室，以PBS洗涤3遍，甲醇固定30min，采用0.1％结晶紫染色30min，于倒置光学显微镜观察计数。随机选取5个视野计数。7、统计学分析采用SPSS19.0统计学软件，实验重复3次，数据资料用均值±标准差表示，样本均数比较采用组间t检验。P<0.05为差异有显著性意义。三、实验结果1、寡肽1～5对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响结果见表1和图1，寡肽1～4可以显著抑制肺癌A549细胞中NGAL基因的表达水平，而寡肽5对肺癌A549细胞中NGAL基因的表达无明显抑制作用。表1寡肽1～5对肺癌A549细胞中NGAL基因表达的影响中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是lipocalin家族的一个成员。研究发现，NGAL在肺癌组织中高表达，有可能是治疗肺癌的一个潜在靶点(参考文献：肺鳞癌及腺癌中NGAL表达的免疫组化研究，实验与检验医学，2014年01期)。2、寡肽1～5对肺癌A549细胞增殖的影响结果见表2和图2，寡肽1～4可以显著抑制肺癌A549细胞的增殖，而寡肽5对肺癌A549细胞的增殖无明显抑制作用。表2寡肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡肽，其特征在于：序列如Sequence NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种寡肽，其特征在于：序列如SequenceNO.3所示。2.权利要求1所述的寡肽用作NGAL基因表达抑制剂的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑嘉荣，
申请(专利权)人：淮安安莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32