合成测序中的多酚添加剂制造技术

本发明专利技术涉及如所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含但不限于用于使用例如合成测序方法确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。特别地，本发明专利技术考虑使用被称为抗氧化添加剂的多酚化合物来提高合成测序反应的效率。例如，没食子酸(GA)在本文中显示为许多示例性SBS多酚添加剂之一。

Polyphenol additives in synthetic sequencing

The present invention relates to methods, compositions, devices, systems and kits as described, including, but not limited to, reagents and mixtures for identifying nucleic acids in nucleotide sequences using, for example, synthetic sequencing methods. In particular, the present invention considers the use of polyphenols called antioxidant additives to improve the efficiency of synthetic sequencing reactions. For example, gallic acid (GA) is shown in this paper as one of many sample SBS polyphenol additives.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成测序中的多酚添加剂专利
本专利技术涉及如所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含但不限于用于使用例如合成测序方法确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。特别地，本专利技术考虑使用被称为抗氧化添加剂的多酚化合物来提高合成测序反应的效率。例如，没食子酸(GA)在本文中显示为许多示例性SBS多酚添加剂之一。背景在过去的25年中，已生成并存入Genbank的DNA序列信息量呈指数增长。传统的测序方法(例如，Sanger测序)正在被使用合成测序形式(SBS)的新一代测序技术所取代，其中使用特殊设计的核苷酸和DNA聚合酶来以受控方式读取芯片结合的单链DNA模板的序列。为了获得高通量，在测序芯片上排列了数百万个这样的模板斑点，并且独立地读出和记录它们的序列。使用阵列进行DNA测序的系统是已知的(例如，Ju等人，美国专利号6,664,079)。然而，仍然需要用于提高核酸序列测序的准确性和/或效率以及增加可用于自动测序的阅读长度的方法和组合物。专利技术概述本专利技术涉及如所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含但不限于用于使用例如合成测序方法确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。特别地，本专利技术考虑使用被称为抗氧化添加剂的多酚化合物来提高合成测序反应的效率。例如，没食子酸(GA)在本文中显示为许多示例性SBS多酚添加剂之一。在一个实施方案中，本专利技术考虑在合成测序(SBS)的裂解步骤期间使用多酚化合物作为裂解试剂的抗氧化添加剂。这种应用方法导致测序性能的显著改善(原始错误率因此支持更长的读长)。这种效果可能是由于通过清除自由基副产物和过量裂解试剂的失活来提高裂解反应的效力。这种自由基副产物可能在流动池中积聚，导致进入随后的延伸步骤，从而导致3'-OH部分的过早去保护并损害单碱掺入率。在一个实施方案中，本专利技术考虑了掺入经标记的核苷酸的方法，包括：a)提供i)多个核酸引物和模板分子，ii)聚合酶，iii)包含还原剂和多酚的裂解试剂化合物，和iv)多个核苷酸类似物，其中至少一部分所述核苷酸类似物用通过可裂解接头(例如二硫化物接头)连接到碱基上的标记物标记；b)将至少一部分所述引物与至少一部分所述模板分子杂交，以产生杂交的引物；c)将第一经标记的核苷酸类似物与所述聚合酶掺入到至少一部分所述杂交的引物中，以产生包含掺入的经标记的核苷酸类似物的延伸引物；d)检测所述掺入的经标记的核苷酸类似物；e)用所述裂解试剂裂解所述掺入的核苷酸类似物的可裂解接头。在一个实施方案中，多酚化合物选自没食子酸，龙胆酸，邻苯二酚，邻苯三酚，对苯二酚和/或间苯二酚(或其组合)。在一个实施方案中，所述裂解试剂的所述还原剂包含TCEP(三(2-羧乙基)膦)。在一个实施方案中，步骤c)的所述掺入的核苷酸类似物还包含封闭3'-OH基团的可去除的化学部分。在一个实施方案中，步骤e)的裂解去除了封闭3'-OH基团的可去除的化学部分。在一个实施方案中，该方法还包括f)将第二核苷酸类似物与所述聚合酶掺入到至少一部分所述延伸引物中。不意欲本专利技术限于标记物的类型。考虑了各种标记物。在优选的实施方案中，所述标记物是发荧光的。本专利技术还涉及组合物和试剂。在一个实施方案中，本专利技术涉及裂解试剂，其包含i)还原剂，和ii)多酚化合物。在一个实施方案中，多酚化合物包括但不限于没食子酸，龙胆酸，邻苯二酚，邻苯三酚，对苯二酚和/或间苯二酚。在一个实施方案中，所述还原剂是TCEP(三(2-羧乙基)膦)。本专利技术还涉及试剂盒，其中提供试剂及其使用说明书。在一个实施方案中，本专利技术涉及试剂盒，其包含：i)裂解试剂和ii)多个核苷酸类似物，其中至少一部分所述核苷酸类似物用通过可裂解接头(例如二硫化物接头)连接至碱基的标记物标记。在一个实施方案中，裂解试剂包含i)还原剂，和ii)多酚化合物。在一个实施方案中，多酚化合物包括但不限于没食子酸，龙胆酸，邻苯二酚，邻苯三酚，对苯二酚和/或间苯二酚。在一个实施方案中，所述还原剂是TCEP(三(2-羧乙基)膦)。本专利技术还考虑了系统，例如具有流动池的系统，其中流动池与试剂的来源连接。参见例如美国专利No.9,145,589，在此引入作为参考。在一个实施方案中，本专利技术涉及包含与溶液中的模板杂交的引物的系统，所述溶液包含裂解试剂，裂解试剂包含i)还原剂，和ii)多酚化合物。在一个实施方案中，多酚化合物包括但不限于没食子酸，龙胆酸，邻苯二酚，邻苯三酚，对苯二酚和/或间苯二酚。在一个实施方案中，所述还原剂是TCEP(三(2-羧乙基)膦)。在一个实施方案中，所述杂交的引物和模板是固定的。在一个实施方案中，所述杂交的引物和模板在流动池中。定义为了便于理解本专利技术，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本领域普通技术人员在与本专利技术相关的领域中通常理解的含义。诸如“一个”、“一种”和“所述”之类的术语不旨在仅指单个实体而且还指多个实体，并且还包括可以用于举例说明的特定实例的一般类别。本文的术语用于描述本专利技术的具体实施方案，但是除了权利要求中所陈述的之外，它们的使用不限制本专利技术。在任何测定测量的背景下，本文所用的术语“约”是指给定测量的+/-5％。如本文所用的术语“接头”是指能够连接易于裂解的标记和/或化学部分的任何分子(或分子集合)。在一个实施方案中，接头的裂解可产生毒性自由基产物。例如，接头可包括但不限于二硫化物接头和/或叠氮化物接头。如本文所用的术语“连接”是指第一分子(例如，核酸)和第二分子(例如，标记分子)之间的任何相互作用。连接可能是可逆的或不可逆的。这种连接包括但不限于共价键合，离子键合，范德华力或摩擦力等。如本文所用的“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸，及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表正义或反义链。此类核酸可包括但不限于cDNA，mRNA或其他核酸序列。如本文所用，术语“分离的核酸”是指已从其天然状态移出的任何核酸分子(例如，从细胞中移出并且在优选的实施方案中，不含其他基因组核酸)。在一些实施方案中，本专利技术考虑将核酸杂交在一起。这需要一定程度的互补性。如本文所用，术语“互补”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(其是指核苷酸序列的可互换术语)。例如，序列“C-A-G-T”与序列“G-T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补性是根据碱基配对规则不匹配一个或多个核酸碱基的情况。核酸之间的“全部”或“完全”互补性是在碱基配对规则下每个核酸碱基与另一个碱基匹配的情况。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中特别重要。如本文所用，关于核苷酸序列的术语“同源性”和“同源的”是指与其他核苷酸序列的互补程度。可能存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。与核酸序列部分互补即“基本上同源”的核苷酸序列是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。可以在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹，溶液杂交等)检查完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或探针将在低严格性条件下竞争并抑制完全同源序列与靶序列的结合(即杂交)。这并不是说低严格性的条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种掺入经标记的核苷酸的方法，包括：a)提供i)多个核酸引物和模板分子，ii)聚合酶，iii)裂解试剂，其包含还原剂和多酚化合物，和iv)多个核苷酸类似物，其中至少一部分所述核苷酸类似物用通过可裂解的二硫化物接头连接至碱基的标记物标记；b)将至少一部分所述引物与至少一部分所述模板分子杂交，以产生杂交的引物；c)将第一经标记的核苷酸类似物与所述聚合酶掺入到至少一部分所述杂交的引物中，以产生包含掺入的经标记的核苷酸类似物的延伸引物；d)检测所述掺入的经标记的核苷酸类似物；和e)用所述裂解试剂裂解所述掺入的核苷酸类似物的可裂解接头。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.11 US 62/293,969;2016.11.09 US 62/419,6851.一种掺入经标记的核苷酸的方法，包括：a)提供i)多个核酸引物和模板分子，ii)聚合酶，iii)裂解试剂，其包含还原剂和多酚化合物，和iv)多个核苷酸类似物，其中至少一部分所述核苷酸类似物用通过可裂解的二硫化物接头连接至碱基的标记物标记；b)将至少一部分所述引物与至少一部分所述模板分子杂交，以产生杂交的引物；c)将第一经标记的核苷酸类似物与所述聚合酶掺入到至少一部分所述杂交的引物中，以产生包含掺入的经标记的核苷酸类似物的延伸引物；d)检测所述掺入的经标记的核苷酸类似物；和e)用所述裂解试剂裂解所述掺入的核苷酸类似物的可裂解接头。2.权利要求1的方法，其中所述多酚化合物选自没食子酸，龙胆酸，邻苯二酚，邻苯三酚，对苯二酚和间苯二酚。3.权利要求1的方法，其中所述裂解试剂的所述还原剂包括TCEP(三(2-羧乙基)膦)。4.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·奥列尼尔，M·G·珀伯斯特，
申请(专利权)人：奇根科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US